馬錢子堿對人乳腺癌裸鼠移植瘤生長的影響及機制探討

宋萬吉，徐夢冉，董文欽，朱耀東，張 梅，李 平

乳腺癌(breast cancer，BC)是全世界婦女中最常見的癌癥類型，為美國女性癌癥死亡的第一大原因[1]。其中三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer， TNBC)占所有乳腺癌的10%～15%[2]，與其他BC亞型相比，TNBC具有預后差、復發率高、轉移率高等特性[3]，逐漸引起人們的重視。馬錢子堿為通絡藥馬錢子的主要生物堿單體，課題組前期體外研究[4]顯示馬錢子堿對BC細胞增殖具有明顯的抑制作用。該實驗觀察馬錢子堿在體內對TNBC生長的影響及探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞株與動物實驗人TNBC細胞系MDA-MB-231細胞購自中國科學院上海生命科學研究所細胞庫，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM 培養液，在 37 ℃、5% CO2濕度穩定的恒溫細胞培養箱中培養。BALB/c(nu /nu) 裸鼠，15～20 g，5～6周齡，雌性，SPF級，飼養環境溫度為20～26 ℃，濕度40%～70%，共20只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，飼養于安徽醫科大學實驗動物中心。動物合格證號:SCXK(京)2016-0006。在本實驗全過程中, 動物處置方法確保符合動物倫理學要求。

1.2 主要試劑高糖DMEM培養基、雙抗、PBS購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液購自美國Gibco公司；馬錢子堿(批號:399027, HPLC≥98%) 購自美國Sigma公司；紫杉醇購自海南魯泰制藥有限公司；二甲基亞砜(DMSO) 購自天津市光復精細化工研究所；Matrigel基質膠(貨號：356234)購自美國Corning公司；凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Anti-Ki-67(ab15580)、Anti-Caspase-3(ab13847)抗體購自上海艾博抗(abcam)貿易有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記山羊抗小鼠IgG(二抗) 購自美國Santa Cruz公司，增強型化學發光自顯影試劑盒(enhanced chemiluminescence, ECL)購自美國Biological Industries公司。

1.3 方法

1.3.1蛋白質印跡法檢測Caspase-3的表達水平 將收集到的細胞加入RIPA細胞裂解液進行裂解, 提取細胞總蛋白。然后加入等體積的電泳上樣緩沖液，于沸水中煮10 min制成電泳樣品, 將樣品等量上樣后進行電泳分離, 冰水浴中恒壓濕轉至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。配置鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-3)單抗(1 ∶5 000),4 ℃反應過夜; PBST洗膜3次, 加入HRP標記的二抗(體積稀釋比例為1 ∶10 000), 室溫反應1 h；PBST洗膜3次, 用ECL顯影試劑盒發光顯影。

1.3.2人BC裸鼠皮下移植瘤的建立 取處于對數生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞，用0.25%的胰酶消化成細胞懸液，用DMEM將細胞濃度配置成1×106/ml,并與Matrigel基質膠等比例混勻，按0.2 ml/只接種于裸鼠右側腋窩皮下。6周后，共有16只裸鼠造模成功，成功率為80%，移植瘤長徑約0.5 cm，其中1只因進食及營養狀況較差，舍棄不用。余下15只裸鼠隨機分為5組：馬錢子堿低、中、高劑量組(15、30、60 mg/kg),陽性對照組(紫杉醇5 mg/kg)和陰性對照組(DMSO)，每組3只。馬錢子堿組和陰性對照組采用灌胃給藥，1次/d；紫杉醇組采用腹腔注射，兩天一次，共用藥4周。期間每周兩次對裸鼠體質量、移植瘤長、短徑進行測量，并按公式計算移植瘤的體積(體積V=a×b2/2，a為長徑，b為短徑)。治療結束后隔天采用脫頸處死法處死裸鼠，剝離移植瘤。

1.3.3荷瘤裸鼠腫瘤生長抑制率 處死小鼠后,剝離完整移植瘤,稱取瘤體質量,計算腫瘤生長抑制率。以每組小鼠的平均瘤重作為療效指標。腫瘤生長抑制率=(1-治療組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)×100%。

1.3.4HE染色 將剝離下來的移植瘤置于4% 的多聚甲醛溶液中固定,依次行脫水,石蠟包埋,行4 μm厚切片。染色前將片子置于60 ℃培養箱加熱過夜,脫蠟，最后進行HE染色并進行顯微鏡下觀察。

1.3.5TUNEL法檢測細胞凋亡 取各組裸鼠石蠟包埋的移植瘤組織切片和多聚賴氨酸包被的玻片，經裱片、烤片處理后，按照原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒提示的步驟進行操作，在顯微鏡下觀察并計數凋亡細胞數目。

1.3.6免疫組化檢測Ki-67及凋亡蛋白Caspase-3 先進行切片脫蠟，用現配3%過氧化氫封閉15 min；PBS洗3次，每次5 min；10%正常山羊血清封閉30 min；封閉后不洗，加一抗孵育(細胞增殖相關核抗原Ki-67為1 ∶5 000；Caspase-3為1 ∶200)。4 ℃過夜;在室溫平衡30 min，用PBS洗3次，每次5 min；二抗孵育，37 ℃ 1 h；PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色；顯色完畢置于蒸餾水，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 不同濃度的馬錢子堿對凋亡蛋白Caspase-3表達的影響分別用DMSO、馬錢子堿(25、50、100、200、400 μg/ml)處理TNBC MDA-MB-231細胞48 h，蛋白質印跡法結果顯示：200、400 μg/ml的馬錢子堿組細胞中Caspase-3剪切體蛋白的表達水平與對照組相比明顯增高，其余濃度與對照組相比，未見明顯改變，見圖1。

圖1 各組馬錢子堿對凋亡蛋白Caspase-3表達的影響

2.2 馬錢子堿對TNBC移植瘤體積及抑瘤率的影響將TNBC細胞系MDA-MB-231細胞注射于裸鼠右側腋窩皮下，約2周后，部分裸鼠在注射部位可觸及小結節，質地堅硬，邊緣清楚，移植瘤長徑約0.3 cm，未出現融合。給藥期間各組裸鼠未出現腹瀉血便以及死亡等不良情況。各組給藥前移植瘤體積無明顯差異，給藥后馬錢子堿高、中劑量組及紫杉醇組移植瘤體積增長較其他兩組明顯變慢；給藥后期，部分馬錢子堿低劑量組及陰性對照組因移植瘤較大，表面出現壞死破潰。治療結束后處死裸鼠，并對小鼠移植瘤體積進行統計分析。在處死過程中發現馬錢子堿高、中劑量組及紫杉醇組移植瘤內部存在液性壞死。結果提示：馬錢子堿(30、60 mg/kg)組移植瘤體積與陰性對照組相比，差異有統計學意義；各組移植瘤體積、平均瘤重及腫瘤生長抑制率結果見表1。各組裸鼠移植瘤大體圖片見圖2。

2.3 馬錢子堿對TNBC移植瘤細胞增殖的影響將各組移植瘤進行HE染色及Ki-67免疫組化。HE染色顯示：BC細胞密度隨馬錢子堿濃度的升高而變的相對稀疏；Ki-67免疫組化提示：隨著馬錢子堿濃度升高，陽性細胞逐漸減少，并且馬錢子堿(30、60 mg/kg)組與陰性對照組及紫杉醇組相比，差異有統計學意義(組間單因素方差分析：F=525.891,P<0.01)。見圖3、4。

表1 馬錢子堿對移植瘤體積及抑瘤率的影響

與陰性對照組比較：**P<0.01；與紫杉醇組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖2 治療結束后各組小鼠剝離的移植瘤大體圖片

A：陰性對照組； B：馬錢子堿低劑量組；C：馬錢子堿中劑量組；D：馬錢子堿高劑量組；E：紫杉醇組

2.4 馬錢子堿對TNBC移植瘤細胞凋亡的影響將各組移植瘤進行TUNEL實驗及Caspase-3免疫組化檢測，結果提示：隨著馬錢子堿濃度升高，陽性細胞數均呈上升趨勢；并且兩組實驗均提示：馬錢子堿(30、60 mg/kg)組陽性細胞數與陰性對照組及紫杉醇組相比，差異有統計學意義(組間單因素方差分析：TUNEL實驗陽性細胞數F1=102.344,P<0.01；Caspase-3免疫組化陽性細胞數F2=214.065,P<0.01)。見圖5、6。

3 討論

BC是全球女性常見的惡性腫瘤之一，同時也是女性癌癥相關死亡的主要原因[5]。其中TNBC是BC的一個亞型，其特征是黃體酮受體、雌激素受體的缺乏和人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)的低表達[6]。與BC其他亞型相比，它具有預后差、復發率高和死亡率高等不良特點[3]?；加羞@種亞型的患者，內分泌治療及HER2靶向治療效果不佳，對細胞毒性化療的長期效果也不太理想[7]，而傳統中藥在抗腫瘤方面有其獨特的優勢，不僅可作用于腫瘤的發生、發展等多個環節，還具有多靶點、多環節、多效應的特點。因此，對中藥成分在抗腫瘤治療機制進行積極探索是非常有意義的。

圖3 對各組裸鼠移植瘤進行HE染色及Ki-67染色 SP×200

A：陰性對照組；B：馬錢子堿低劑量組；C：馬錢子堿中劑量組；D：馬錢子堿高劑量組；E：紫杉醇組；1：HE染色；2：Ki-67染色

圖4 各組移植瘤Ki-67免疫組化陽性細胞數占陰性對照組百分比

與陰性對照組比較：**P<0.01；與紫杉醇組比較：##P<0.01

圖5 各組移植瘤TUNEL實驗及Capase-3免疫組化 SP×200

A：陰性對照組；B：馬錢子堿低劑量組；C：馬錢子堿中劑量組；D：馬錢子堿高劑量組；E：紫杉醇組；1：TUNEL實驗；2：Caspase-3

圖6 各組移植瘤TUNEL實驗及Caspase-3免疫組化陽性細胞數

與陰性對照組比較：**P<0.01；與紫杉醇組比較：##P<0.01

馬錢子堿為中藥馬錢子的主要生物堿單體。馬錢子為馬錢科植物長籽馬錢或馬錢的干燥種子，具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤和抑制免疫等藥理作用[8]。本實驗組前期研究表明，馬錢子堿能夠抑制BC骨轉移[9]，誘導體外BC細胞凋亡[10]，本實驗通過建立裸鼠BC皮下移植瘤模型，給予不同濃度馬錢子堿治療，結果顯示：隨馬錢子堿濃度的升高，移植瘤體積逐漸變小，并且對BC細胞的增殖起到抑制作用。為進一步研究馬錢子堿對BC移植瘤抑制作用的機制，本實驗對馬錢子堿在體內對BC的凋亡作用進行探討。

凋亡是一種由基因介導的程序性細胞死亡，在發育、免疫和疾病的過程中可以消除受損或多余的細胞有助于確保機體的健康[11]。而細胞凋亡大多數通過Caspase介導的信號途徑完成，其中心環節為Caspase-3的激活，它能激活Caspase活化的核酸內切酶,進而對DNA進行切割[12]。本實驗通過體外蛋白質印跡法檢測不同濃度的馬錢子堿對凋亡蛋白Caspase-3表達的影響，結果提示相對較高濃度的馬錢子堿(200、400 μg/ml)組細胞中Caspase-3剪切體蛋白的表達水平與馬錢子堿其他劑量組及對照組相比明顯增高；對裸鼠移植瘤進行TUNEL實驗及Caspase-3免疫組化，結果提示馬錢子堿可以誘導BC細胞的凋亡，對TNBC細胞在體內的無限增殖起到抑制作用。但誘導凋亡的具體機制未明確，還需進一步探討。

綜上所述，馬錢子堿可以抑制TNBC移植瘤的生長，其機制可能與誘導BC細胞凋亡有關。