毛囊角化病一家系及三例散發患者ATP2A2基因突變研究

夏倩倩 趙 晴 孫樂樂 于功奇 楊 青 王廣進吳 梅 劉永霞 陳聲利 孫勇虎 劉 紅 張福仁

毛囊角化病于1889年由Darier首次命名，故又稱Darier病(Darier’s disease, DD)，是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，人群發病率在1/30000到1/100000之間[1]。臨床表現為覆有油膩性結痂的毛囊性丘疹，有時可伴有惡臭和瘙癢，好發于腹股溝、腋下等皮膚脂溢部位，部分患者也可累積掌跖。DD常在青春期發病，日曬、高溫、潮濕可加重病情[2]。1993年Craddock等[3]對英國的DD家系進行連鎖分析，首次將該病的致病基因定位于染色體12q23-24.1，1999年Sakuntabhai等[4]將DD致病基因定位于12q23-24.1上編碼肌漿/內質網鈣離子-ATP酶2(SERCA2)的ATP2A2基因。目前為止，研究者已在不同家系或散發病例中發現了250多種不同的ATP2A2基因突變(http://lovd.nl/ATP2A2)，其突變類型多樣，以錯義突變最為常見[5]。在本研究中，我們收集了1家系及3例散發DD患者，通過PCR擴增和Sanger直接測序法對ATP2A2基因進行突變檢測，并對已報道的ATP2A2基因突變進行了文獻回顧。

1 對象與方法

1.1 研究對象 在山東省皮膚病醫院皮膚科門診，收集經臨床及組織病理確診的1家系及3例散發DD患者。

家系1共3代人，患者3例，其中男1例、女2例(圖1)。先證者(I1)男，67歲，自16歲開始頭、頸、背部及四肢開始出現淺褐色油膩性角化性丘疹，伴癢，夏季嚴重，皮損漸重，融合成片，因搔抓后出現疣狀增生，甚至破潰、滲出,結痂(圖2a)。其女(II2)，與先證者臨床表現相似(圖2b)；其外孫女 (III1)，病情較輕，在頸部、腹部、下肢散見質實小丘疹(圖2c)。

散發患者S1：女，53歲；頭面部、腋窩、腹部可見暗紫紅色丘疹，糜爛、少量滲液(圖2d)。散發患者S2：女,32歲；頭皮、腋窩、腹股溝、乳房下叢集分布褐色丘疹、表面覆有油膩性痂皮(圖2e)。散發患者S3：男，26歲；面頰、頸、軀干部角化性丘疹伴癢(圖2f)。

以上6位患者均經組織病理確診(圖2g)：表皮角化過度伴角化不全，棘層松解有腔隙形成，可見絨毛、圓體和谷粒細胞，真皮淺層炎細胞浸潤，診斷為毛囊角化病。并按照Burge等[2]制定的標準分為輕、中、重度。

圖1 家系圖

2a、2b：家系患者I1、II2軀干、上肢、頭面部，角化性丘疹，上覆褐色油膩性痂皮，部分融合成疣狀斑塊，可見破潰,結痂；2c：家系患者III1頸部散見質實小丘疹；2d：散發患者S1腋部浸漬樣暗紫紅色斑丘疹；2e：散發患者S2胸腹部散在褐色角化性丘疹；2f：散發患者S3：軀干部彌漫分布的褐色角化性丘疹，上覆油膩性痂皮；2g:表皮角化過度伴角化不全，棘層松解有腔隙形成，可見絨毛、圓體和谷粒細胞(HE，×200)

圖2患者臨床和組織病理

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 提取 本研究經山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會批準，簽署知情同意書后，抽取患者及其家屬外周血5 mL(其中散發患者家屬外周血未取得)，同時采集100名無親緣關系的正常個體外周血5 mL作為對照，-80℃保存。采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組DNA，并用全波長紫外/可見光掃描分光光度計ND-8000(Thermo Fisher公司，美國)測定其純度及含量，將其標化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增ATP2A2基因全部外顯子及側翼序列 根據既往報道的文獻[6]設計特異性引物18對，交由北京華大基因科技有限公司合成。25 μL PCR反應體系為:PCR taq mix 12.5 μL，dNTP上下游引物各1 μL，DNA模板(30 ng/μL)0.5μL，ddH2O 10 μL。PCR反應條件：預變性94℃ 10 min，變性94℃ 30 s，退火55℃～59℃ 45 s ，延伸72℃ 10 min，共進行35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 DNA測序 PCR產物經醋酸鈉-乙醇沉淀法純化后直接于ABI 3130XL基因分析儀(Applied Biosystems,美國)上進行測序。

1.2.4 突變分析 所有測序結果經NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等數據庫進行分析比對，利用SIFT及Polyphen-2軟件對基因突變進行功能預測。

2 結果

家系中3例患者均攜帶同一突變，為ATP2A2基因第380位鳥嘌呤突變為胞嘧啶(c.380 G>A)，導致密碼子出現GGC→GAC的改變，使得第127位氨基酸從甘氨酸(G)變為天冬氨酸(D)(p.G127D)(圖3a)，家系中非患者及100名正常對照均未發現該突變。

散發病例S1中發現ATP2A2基因第1676位鳥嘌呤突變為胞嘧啶(C.1676G>A)，使第559位密碼子由CGA變為CAA，導致精氨酸(R)被谷氨酰胺(Q)替代(p.R559Q)(圖3b)；散發病例S2患者ATP2A2基因第2001位發現一同義突變c.2001C>T，密碼子GAC被GAT替代，但氨基酸Asp未變化(圖3c)；散發病例S3未發現ATP2A2突變。在家系中非患者和100名正常對照中未發現上述突變(3a～f)。

利用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu)對非同義突變對蛋白質的影響進行分析，發現p.G127D與p.R559Q的預測值分別為0.973和1，預測表明對蛋白質結構影響均為“probably damaging”。

利用ExAC、TOPMed數據庫對該突變檢索，結果顯示T的基因頻率分別為0.00002474、2.38910e-05，檢索gnomAD數據庫顯示在東亞人群中T的基因頻率為1.08767e-05。此外，我們利用ASSP(http://wangcomputing.com/assp/)對該突變位點所在序列進行選擇性剪接位點預測，結果顯示該突變位點對剪接位點無影響。

檢索Pubmed和萬方數據庫自1999年至今發表的有關本病ATP2A2基因突變的文章，發現已有250多種不同的突變被報道，其中在 2009年報道了一例38歲的突尼斯重癥DD女性患者，其與本研究中散發患者S1攜帶相同突變基因c.1676G>A[6]；2010年在一斯洛文尼亞家系中發現同為第559位氨基酸的突變，由于第1675位堿基由胞嘧啶突變為鳥嘌呤(c.1675C>G)，而使精氨酸變為甘氨酸(p.R559G)[7]；2011年意大利人群中在第559位氨基酸上發現一無義突變c.1675C>T(p.G559*)[8]。

3a：家系的5號外顯子上存在一新發錯義突變c.380G>A(p.G127D)；3b： S1患者13號外顯子上存在一錯義突變C.1676G>A (p.R559Q)；3c： S2患者14號外顯子上存在一同義突變c. 2001C>T (p.D667D)；3d、3e、3f：正常對照序列

圖3患者突變檢測結果

3 討論

人類ATP2A2基因長約76 Kb，包含21個外顯子,該基因編碼SERCA2蛋白，SERCA2將鈣離子從胞漿轉移至內質網內并對表皮的細胞連接和分化起重要作用[9]。1999年Ruiz-Perez等發現只有該基因編碼的SERCA2b亞型在皮膚中高表達，SERCA2b亞型主要由胞質部分的3個結構域:執行元件域(A)、磷酸化域(P)、ATP結合域(N)和11個跨膜蛋白(M1-M11)組成，其中3個結構域在鈣離子結合和構型改變方面起重要作用[10]。SERCA2b亞型具有更高的鈣離子親和力，同時其催化周轉率更低，當其發生突變時會通過降低鈣離子親和力和加快鈣離子周轉率來使內質網內的鈣離子濃度發生改變，也可通過內質網應激反應引起棘層松解、細胞凋亡，最終導致DD的發生[11]。目前已發現的突變位點分散于整個基因，很少出現相同突變，且基因型和表型的相關性也尚未明確[5，10]。

本研究共發現兩個錯義突變，在該家系的5號外顯子上存在一新發錯義突變，即c.380G>A，使其編碼的甘氨酸變為天冬氨酸(p.G127D)，該突變位于A結構域，該結構域在鈣離子通過SERCA2時起杠桿作用[10]。檢索國內外文獻在該氨基酸上尚未發現其他突變。散發患者S1的13號外顯子上發現一錯義突變C.1676G>A，使599位的精氨酸變為谷胺酰胺，即p.R559Q，該突變位于ATP結合域，回顧文獻發現，在突尼斯人群中發現相同突變，在斯洛文尼亞和意大利人群中發現同為第559位氨基酸的突變，由此進一步證實了該病不存在種族差異，并推測位于559位的精氨酸為該基因的突變熱點。這兩種突變均可能導致SERCA2蛋白翻譯異常，或表達單倍劑量不足，引起鈣離子儲備耗盡或內質網中鈣離子濃度變化，從而影響到表皮細胞分化、細胞間連接等，最終導致DD的發生[12]。在S2患者14號外顯子上發現一同義突變c. 2001C>T，利用ExAC、TOPMed、gnomAD數據庫對該突變檢索,均顯示該突變極為罕見。此外，我們利用ASSP對該突變位點所在序列進行選擇性剪接位點預測，結果顯示該突變位點對剪接位點無影響，散發患者S3中未發現突變，猜測致病突變位點可能發生在未測序區：如啟動子區域、內含子序列或3’非翻譯區域[4]。環境、生活習慣等其他因素也可能影響ATP2A2基因的表達，從而影響SERCA2蛋白的功能，另外，該病可能存在其他致病基因。

本家系中三位患者攜帶相同的突變位點，I1、II2患者的病情均十分嚴重，只有III1的癥狀輕微，認為可能與該患兒年齡較小有關。總結存在第559位氨基酸突變的患者的臨床表現，其中有3例臨床表現為重度、1例為輕度、1例為中度，提示DD病情的嚴重程度與基因型相關性的復雜性。

總之，本研究共發現2種錯義突變，均在國內首次報道，豐富了ATP2A2基因的突變數據，有助于進一步探討ATP2A2突變和DD之間的關系，進而有助于今后開展DD的遺傳咨詢和產前診斷。DD臨床表型和基因型之間的關系有待進一步研究。