熒光染色法和氫氧化鉀濕片法在診斷淺部真菌感染中的敏感度比較

楊顏龍 張素敏 易松柏 周天玖 張 禁

氫氧化鉀濕片法是門診真菌鏡檢常用的方法。其對經驗要求較高，視野對比度較差，易出現漏診或誤診。近年熒光染色法漸用于真菌鏡檢領域，其機理是：真菌細胞壁上的幾丁質，可與熒光染色劑里的熒光素產生特異性結合，在特定波段紫外光照射下，菌絲和孢子發出亮綠或亮藍色的熒光，易于區分背景和雜質。本研究分別應用兩種方法同視野下檢測淺部真菌感染患者466例，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院皮膚科門診2017年8月至2018年8月臨床表現典型[1]的淺部真菌感染患者466例，其中手足癬181例、體股癬168例、花斑糠疹52例、甲癬40例、頭癬25例；分別選擇其易檢出部位的皮屑、甲屑、斷發發根作為檢驗標本。

1.2 入選標準 臨床表現與病史符合淺部真菌感染且近期局部或系統未使用過抗真菌藥物者。

1.3 研究方法 檢驗師先使用氫氧化鉀濕片法，對患者進行取材、鏡檢至判定結果；再由同一皮損區取材，熒光染色法不開熒光燈、打開熒光燈鏡檢，分別判定結果并分別計時。再由護士使用兩種方法來判定結果并分別計時。計時分取材制片和讀取結果兩段。由另一名檢驗師再次復核結果，若檢驗結果有爭議，則重新制片觀察。由一名醫師負責本研究診斷、計時、拍照、統計任務。

1.4 取材及檢測方法 皮損處均用75%乙醇消毒后取材。手足癬、體股癬、花斑糠疹均取皮屑，鈍頭刀刮取皮損炎性活動邊緣鱗屑；甲癬取甲屑，先刮除表層的碎甲屑，再取接近正常甲組織的甲下碎屑；頭癬取斷發發根，鑷子拔取病發。取材時，載玻片需要放置在水平位置上，將刮取的標本均勻置于載玻片中心。氫氧化鉀濕片法滴上一滴氫氧化鉀液，蓋上蓋玻片輕壓排出氣泡，使用酒精燈略微加熱，再次輕壓攤勻標本。用加裝萊卡熒光顯微鏡圖文分析系統的奧林巴斯 CX31顯微鏡觀察。熒光染色法則滴上一滴真菌熒光染色液(蘇宿械備20170027號)，覆蓋整個樣品，據標本不同，靜置30 s～2 min不等，蓋上玻片，然后輕壓，擠出氣泡，鋪勻標本，完成制片。用同一臺顯微鏡觀察，先不開熒光，用10倍物鏡尋找真菌視野，40倍物鏡觀察確認，確定是否有真菌菌絲或孢子結構存在，并拍照，過程同普通氫氧化鉀濕片法。然后打開熒光，尋找菌絲、孢子。在有無熒光的同視野下拍照、存檔。最后，分別統計出熒光染色法和氫氧化鉀濕片法的陽性率，分析比較。

1.5 統計學方法 計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 同視野下氫氧化鉀濕片法與熒光染色法直觀比較 甲癬、手癬、頭癬的檢測中，兩種方法差別明顯。氫氧化鉀濕片法的背景雜亂、孢子、菌絲不易辨認、陽性率低，需費時尋找陽性目標。特別是由護士來讀取結果時，常會把陽性結果判斷為陰性，而打開熒光后，菌絲、孢子顯現清晰，可快速確認陽性目標。無論護士和檢驗師，所得結果基本一致。花斑糠疹、體股癬、足癬，陽性率均較高，兩種方法差別不大，但熒光染色法的陽性率更高。從效果來看，單純使用氫氧化鉀制片和使用熒光液制片且不打開熒光燈，得到的效果是基本沒有區別。各種淺部真菌病在同一標本、同視野下采用兩種方法觀察，顯示熒光染色法陽性率高、敏感度高。見圖1～6。黑色箭頭所指為陽性目標(菌絲、孢子)、紅色箭頭所指為易干擾診斷的東西(雜質、重偽影、氣泡等)。

圖11a:體癬標本，菌絲與背景對比差，但可見到菌絲(×400)；1b:菌絲與背景對比良好，菌絲明顯(×400)圖22a:足癬標本，可見菌絲，有偽影(×400)；2b:菌絲明顯，偽影消失(×400)圖33a:甲癬標本，菌絲不易找到，可見氣泡、雜質(×100)；3b:視野中心見明顯菌絲，可見氣泡、雜質(×100)圖44a:花斑糠疹標本，可見大量短棒狀菌絲，與背景對比度不高，未見到孢子；可見黑色雜質干擾判斷(×400)；4b:可見大量明亮的短棒狀菌絲，且可見圓形孢子，未見雜質(×400)圖55a:頭癬標本，可見毛根殘缺，隱約可見孢子或者菌絲；右下方是否為孢子不易判斷(×100)；5b:發根處明顯鏈狀孢子，右下方看到成堆的孢子(×100)圖66a:頭癬標本，為圖5的局部(發根的右上部分)，亦可見到鏈狀孢子；右側可見雜質(×400)；6b:鏈狀孢子顯影良好，雜質顯影不明顯(×400)

2.2 氫氧化鉀濕片法與熒光染色法陽性率比較 兩種方法的總陽性率分別為91.42%和97.64%，有統計學差異(χ2=17.46，P<0.05)。見表1。

表1 兩種方法在各種淺部真菌病鏡檢結果比較

3 討論

氫氧化鉀濕片法真菌鏡檢臨床應用多年，目前仍有其應用價值[1]。但該方法用于甲屑堅硬、皮屑肥厚的甲癬、手癬、頭癬時，常需加熱，制片過程平均需3 min左右，影響效率[2]。熒光染色法真菌鏡檢，滴加熒光液1 min左右，無需加熱即可開始讀取結果。讀取結果時，氫氧化鉀濕片法視野內，背景與真菌菌絲、孢子的色澤和亮度差別不大，特別是操作人員經驗不足時，常反復調整視野層面、來回多個視野尋找，才敢確認是否陽性。如檢驗師平均2 min內，可以確認陽性的標本，經驗不足的護士，則需要5 min左右，其對操作人員的經驗依賴性大。而熒光染色法，菌絲、孢子會顯示出亮藍的熒光，與視野背景對比度高，檢驗師、護士均能在1 min內確認結果是否陽性，工作效率較高。

在花斑糠疹、體癬、股癬、足癬檢查時，因標本細薄，易于溶解，且菌絲、孢子形態易于辨認，檢驗師與護士所需時間差別不太明顯，但制片過程仍是熒光染

色法的效率較高。兩種方法都會因雜質、氣泡等而干擾判斷，尤其氫氧化鉀濕片法，雜質、氣泡、油脂滴常被誤認為是菌絲、孢子，經驗不足時，更易誤判。在使用熒光后，真菌孢子、菌絲顯示明亮的藍色熒光，與背景微弱灰藍色對比明顯，可一目了然判斷孢子、菌絲是否存在，提高真菌檢查陽性率及準確率[3]。

本研究同視野下比較兩種檢查方法，與其他研究相比較，更能體現出熒光法的優勢[4，5]。目前兩種檢測方法均有其臨床使用價值，但熒光染色法操作更簡便、敏感度高，檢出結果快速、準確，值得臨床應用。