積雪苷軟膏對BALB/C裸小鼠瘢痕疙瘩模型成纖維細胞及膠原蛋白表達的影響

楊 艷 郭桂珍 王衛(wèi)濤 馬春鋒

瘢痕疙瘩(keloid)最顯著的病理特征是成纖維細胞持續(xù)活化所產生的高水平的膠原、纖連蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖等細胞外基質成分，尤其是膠原的過度堆積，從而導致真皮的持久纖維化[1]。積雪苷是萃取于天然藥用植物積雪草的有效成分，因其具有抗炎作用，能抑制瘢痕形成而考慮將其用于瘢痕疙瘩的治療，前期我們已經在細胞水平證實積雪苷能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并下調結締組織生長因子(CTGF)的表達[2],現在我們建立了瘢痕疙瘩裸鼠模型,在穩(wěn)定的內環(huán)境中觀察外用積雪苷軟膏對瘢痕疙瘩成纖維細胞及其膠原蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及標本來源 實驗動物:BALB/C品系裸小鼠，SPF級，6～8周齡，共16只，雌雄不限，每只重20～23 g，由青島農業(yè)大學實驗動物中心提供。瘢痕疙瘩標本來源于城陽人民醫(yī)院皮膚科瘢痕疙瘩患者(經醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書)，手術取材于前胸部及肩部瘢痕組織。患者年齡16～45歲，平均(30.53±7.19)歲。瘢痕疙瘩的診斷標準參照1992年Darzi診斷標準[3]。入選標準：2年內未接受藥物注射、放療或外科治療，無系統疾病者。

1.2 主要試劑及儀器 積雪苷軟膏由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供(濃度為0.00125%、0.0025%、0.005%)，兔抗人I型膠原多克隆抗體，克隆號BA0325(武漢博士德生物技術有限公司)，PV-9000非生物素通用型二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，LAB VISION自動免疫組化染色儀，透射電子顯微鏡(JEM-1230，JEOL Inc公司，Japan)。

1.3 建立動物模型及分組治療 取6～8周齡,體重20～23 g/只,BALB/C裸小鼠,將外科手術切除的瘢痕疙瘩組織立即在無菌條件下切成8 mm×5 mm×5 mm大，植入裸鼠兩側肩胛部各一塊及骶尾部一塊。兩周后，組織塊存活，無感染及排斥現象，將16只瘢痕疙瘩裸小鼠隨機分為四組，A組外用對照軟膏基質，B組外用0.00125%積雪苷軟膏，C組外用0.0025%積雪苷軟膏，D組外用0.005%積雪苷軟膏，屏障環(huán)境無菌條件下以棉簽蘸藥膏，順時針方向均勻涂抹，每日三次，同時觀察局部皮膚反應、組織變化、裸小鼠的全身情況。

1.4 組織病理檢查 用藥后6周取出所有植入的瘢痕疙瘩組織塊，觀察組織塊形態(tài)，測量其體積，將之切分為兩半，送透射電鏡檢查；送常規(guī)病理。

1.5 I型膠原蛋白免疫組化 采用LAB VISION 2D全自動免疫組化染色儀，ELIVISON二步法進行染色。從自動免疫組化染色儀中取出已染色完畢的切片，蘇木素復染，0.1%HCL分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥二甲苯透明，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗處理的切片作為空白對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。結果判定：I型膠原的免疫組織化學評分采用半定量判斷指標：每組24張切片，顯微鏡下，每張切片選擇染色良好區(qū)域觀察，隨機取5個視野，由兩位病理診斷醫(yī)生雙盲判讀。高表達率切片呈棕黃色或棕褐色。根據膠原纖維著色面積及陽性染色強弱進行判斷。著色強弱計分：未著色計分為0，淡黃色計分為1，棕黃色或棕褐色計分為2；著色面積計分：著色面積在10%以下計分為0，陽性面積在10%～25%計分為1，陽性面積在26%～50%計分為2，陽性面積在50%以上且著色較深計分為3。上述兩項相加，≤1為陰性(-)，2為弱陽性(+)，3為中等陽性(++)，≥4為強陽性(+++)。統計學方法：實驗數據以α=0.05為標準，應用Stata7.0統計分析軟件，進行χ2檢驗，Fisher精確概率法計算。

1.6 透射電鏡檢查 將已修成1 mm3的瘢痕疙瘩組織塊置預冷的4%戊二醛固定液中，固定2 h；在4℃下進行梯度脫水, 將脫水后樣品進行浸透、包埋, 顯微鏡下用手術刀片修塊；組織切片機上先切取數張2 μm厚的半薄切片，1% 甲苯胺藍溶液染色，光鏡下觀察定位后在超薄切片機上超薄切片，厚度為70 nm左右，讓其貼附在有支持膜的銅網上，檸檬酸鈉-硝酸鉛復染10 min，JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 肉眼觀察 各組裸小鼠均存活，生活狀態(tài)良好，飲食、大小便、體重增長、活動均正常。A組(對照組)用藥至第六周時局部皮膚完好，組織塊大小、硬度無明顯變化；B組(0.00125%濃度組)用藥兩周后局部皮膚稍紅,但無靡爛、破潰，繼續(xù)用藥后皮膚又恢復正常，用藥至第六周時組織塊平均體積稍縮小，質地中等；C組(0.0025%濃度組)用藥兩周后局部皮膚稍紅，繼續(xù)用藥時可見小鼠抓撓用藥處，三周時用藥局部出現點狀表皮缺損，組織塊完好，繼續(xù)用藥至第六周時局部點狀表皮缺損愈合，組織塊平均體積縮小，表現為厚度變薄，3.5～4 mm，質地中至軟；D組(0.005%濃度組)用藥兩周后局部皮膚稍紅，繼續(xù)用藥時可見小鼠抓撓用藥處，三周時用藥局部出現點狀表皮缺損，組織塊完好，繼續(xù)用藥至第六周時局部點狀表皮缺損未愈，組織塊平均體積縮小，表現為厚度明顯變薄，3～3.5 mm，質地中至軟。見圖1～6。

圖1植入前的瘢痕疙瘩組織塊圖2A組6 w時組織塊外觀圖3B組用藥至6 w時組織塊外觀圖4C組用藥至3 w后局部出現點狀表皮缺損，6 w后愈合圖5D組用藥6 w時取組織塊圖6C組用藥后組織塊體積縮小

2.2 光鏡觀察 用藥6周后取瘢痕疙瘩組織塊，常規(guī)HE染色，光鏡下A組組織結構與移植前相似，可見成纖維細胞數較多，膠原纖維粗大，排列紊亂，邊緣可見較多微血管；B組、C組、D組均可見成纖維細胞數明顯減少，組織塊邊緣膠原纖維變細呈波浪狀，排列整齊，部分中央膠原纖維仍粗大，呈結節(jié)、漩渦狀，組織塊邊緣處有少量炎癥細胞浸潤。變化以C、D組為明顯。見圖7、8。

2.3 I型膠原蛋白免疫組織化學染色 染色結果(-)、(+)設為低表達，(++)、(+++)為高表達。檢測結果應用χ2檢驗，Fisher精確概率法計算。見圖9～12。I型膠原表達情況見表1、2。外用積雪苷軟膏后，B組、C組、D組總膠原高表達的陽性率分別為70.83%、37.50%、33.33%，對照組A組總膠原高表達的陽性率為79.17%，實驗組膠原高表達的陽性率明顯降低，四組率比較，Fisher精確概率檢驗法計算(P=0.001)，差別具有統計學意義。再進行四組率的兩兩比較，應用Scheffé可信區(qū)間法，A組與B組比較，95%可信區(qū)間為(-0.2643～0.4311)，可信區(qū)間包含0，此兩組間的差異無顯著性；A組與C組比較，95%可信區(qū)間為(0.0562～0.7772)，可信區(qū)間不包含0，兩組間差異具有統計學意義；A組與D組比較，95%可信區(qū)間為(0.1035～0.8133)，可信區(qū)間不包含0，兩組間差異具有統計學意義；B組與C組比較，95%可信區(qū)間為(-0.0455～0.7121)，可信區(qū)間包含0，兩組間差異無統計學意義；B組與D組比較，95%可信區(qū)間為(0.0015～0.7465)，可信區(qū)間不包含0，兩組間差異有統計學意義；C組與D組比較，95%可信區(qū)間為(-0.3438～0.4272)，可信區(qū)間包含0，兩組間差異無統計學意義。

表1 I型膠原蛋白陽性表達數列表

表2 I型膠原蛋白表達統計表

2.4 透射電鏡觀察 透射電鏡觀察顯示：A組成纖維細胞數量仍多，細胞核膜清晰，核仁明顯，有較豐富的細胞器，粗面內質網和線粒體中等，核糖體和高爾基器豐富，膠原豐富，排列紊亂。B、C、D組成纖維細胞明顯減少，可見凋亡細胞，細胞核固縮，膜結構不清，有壞死的細胞碎片及裸核狀態(tài)的成纖維細胞。粗面內質網擴張，呈囊泡狀，線粒體空泡變，膠原纖維溶解，可見細胞內、細胞外凋亡小體的產生。此變化以C、D組較明顯。見圖13、14。

圖7C組用藥6 w后見成纖維細胞數明顯減少，邊緣膠原纖維排列整齊、疏松、趨于正常真皮結構(HE,×100)圖8對照基質外用6 w后見成纖維細胞數較多，膠原纖維粗大、排列紊亂(HE,×100)圖9A組，I型膠原表達(免疫組化,×100)

圖10B組I型膠原表達(免疫組化，×100)

圖11C組I型膠原表達(免疫組化,×100)圖12D組I型膠原表達(免疫組化,×100)圖13C組6 w后透射電鏡下見成纖維細胞核固縮，膜結構不清，膠原纖維溶解(標尺為1 μm)圖14A組6 w后透射電鏡下見成纖維細胞內有豐富的粗面內質網、核糖體(標尺為1 μm)

3 討論

瘢痕疙瘩是一種臨床上常見的纖維增生性疾病，是以皮膚受創(chuàng)傷后真皮異常纖維增生反應為特征的病理性組織。其形成機制尚未明了，近年來越來越多的學者傾向于認為瘢痕疙瘩是一種良性的皮膚腫瘤[4]，目前臨床上一般主張應用綜合療法，多采用手術切除聯合糖皮質激素注射、壓力療法、硅膠片敷貼、術后淺層放療等進行綜合治療[5]。但上述療法或存在一定的創(chuàng)傷性，或應用不便，或費用較高，而且不能完全抑制瘢痕疙瘩的復發(fā)。在此基礎上，人們一直在尋找更為方便、安全、有效的治療方法來輔助治療，降低復發(fā)率。積雪苷能抑制成纖維母細胞增殖，降低轉酰氨基酶活化，減少酸性黏多糖和膠原量，使結締組織的基質和纖維成份的過度增生受到控制，對無秩序的瘢痕疙瘩增生具有抑制和緩解作用[6]；而且積雪苷通過抑制瘢痕的Smad通路使成纖維細胞增殖受阻改變成纖維細胞的超微結構 ,促進其凋亡[7]，積雪苷還可以通過降低TGF-β1達到促進一型膠原降解，減輕瘢痕增生的作用[8]。前期我們已經證實在體外細胞水平上積雪苷能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并下調CTGF的表達，且還與積雪苷作用濃度存在一定的依賴性，本實驗從裸鼠瘢痕疙瘩模型中證實外用積雪苷軟膏能減少瘢痕疙瘩成纖維細胞并下調I型膠原蛋白的表達,為臨床用藥提供理論基礎。