12種竹筍蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用

楊慧敏 吳良如 楊金來(lái)

摘要 [目的]探討不同種類(lèi)竹筍蛋白的抗癌活性。[方法]采用植物活性蛋白提取試劑盒提取竹筍蛋白，CCK-8法檢測(cè)不同濃度竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖抑制作用，72 h后顯微拍照記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并計(jì)算IC50值。[結(jié)果]12種竹筍蛋白在體外均可強(qiáng)效抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖，但抑制效果并不完全相同，在一定范圍內(nèi)，其抑制率與濃度呈正相關(guān)，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。[結(jié)論]12種竹筍蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞，如胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖均有顯著的抑制作用，為今后進(jìn)一步研發(fā)竹筍源的低毒、高效的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 竹筍蛋白;人胃癌細(xì)胞SGC-7901;人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116;增殖;抑制

中圖分類(lèi)號(hào) Q 946.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0181-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.050

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to investigate the anticancer activity of proteins of different species of bamboo shoots.[Method]The proteins of bamboo shoots were extracted with the plant active protein extraction kit.CCK8 assay was used to detect the inhibitory effect of proteins of bamboo shoots with different concentrations on the proliferation of gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116.After 72 h，the growth of cells was observed and photographed by microscope，and its IC50 value was calculated.[Result]All proteins of the 12 kinds of bamboo shoots could strongly inhibit the proliferation of gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116 in vitro，but the inhibitory effect was not completely the same.Within a certain range，the inhibitory rate was positively correlated with the concentration，showing a certain doseeffect relationship.[Conclusion]All proteins of the 12 kinds of bamboo shoot have significant inhibitory effects on the proliferation of tumor cells，such as gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116，which provide a foundation for further research and development of the low toxicity and high efficiency antitumor drugs from bamboo shoots.

Key words Bamboo shoot protein;Gastric cancer cell SGC7901;Colon cancer cell HCT116;Proliferation;Inhibition

惡性腫瘤是危害人類(lèi)生命和健康的嚴(yán)重疾病之一，從天然產(chǎn)物中篩選出能與癌癥發(fā)生、發(fā)展、形成等過(guò)程中各調(diào)節(jié)靶點(diǎn)特異結(jié)合的活性成分，已成為尋找抗癌藥物的新熱點(diǎn)。近年從植物中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的抗腫瘤活性蛋白或多肽，已成為藥物研發(fā)中的一個(gè)活躍領(lǐng)域。Porro等[1]將從苦瓜中分離出的蛋白與抗CD5單克隆抗體偶聯(lián)，結(jié)果表明，偶聯(lián)后的苦瓜蛋白在體外可抑制外周血單核細(xì)胞及人T細(xì)胞蛋白和 DNA的合成，并能抑制白血病小鼠病情的發(fā)展，有效率達(dá)80%;陳元[2]從蓖麻中分離到一個(gè)66 kD的蓖麻毒蛋白，該蛋白是一種廣譜型抗癌活性蛋白，對(duì)食道癌細(xì)胞EC109 和肝癌細(xì)胞 SMM7721 具有直接殺傷作用，并且在低劑量時(shí)就可以使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。一般認(rèn)為植物源活性蛋白主要通過(guò)直接殺死腫瘤細(xì)胞和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[2];抗突變和抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3];抑制蛋白質(zhì)的合成抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[4];抑制相關(guān)酶的活性抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用[5-6]。

竹筍是從竹子根狀莖上萌發(fā)分化而成的膨大的芽和幼嫩的莖。Wang等[7]從麻竹筍中分離到一種20 kD的抗真菌蛋白Dendrocin，它能抑制菌絲體的生長(zhǎng)，經(jīng)分析N端序列發(fā)現(xiàn)其與類(lèi)甜蛋白相似，但分子量更小些，且這種蛋白不像其他抗菌蛋白一樣具有紅細(xì)胞凝集和核糖核酸酶活性;Maekawa等[8]從竹筍中分離到3個(gè)與酪蛋白激酶 Ⅱ 相關(guān)的60S酸性核糖體P蛋白（13、15和35 kD）具有很強(qiáng)的體內(nèi)磷酸化抑制作用。筆者曾就24個(gè)不同種屬的竹筍蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖活性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24種竹筍蛋白在體外均可不同程度地抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴(lài)關(guān)系[9]。基于此，該研究將對(duì)另外12種不同種屬的竹筍蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖活性進(jìn)行研究，試圖從中篩選出對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)的竹筍蛋白，為今后開(kāi)發(fā)低毒、高效的抗腫瘤活性竹筍蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 竹筍。

桂竹、斑竹、唐竹、茶竿竹于2017年4月采集自臨安竹種園，撐綠竹3號(hào)、粉單竹、黃麻竹、吊絲單竹、馬來(lái)甜龍竹、勃氏甜龍竹、毛腳龍竹于2017年8月采集自福建永安竹種園，于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 腫瘤細(xì)胞。人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（http：//www.cellbank.org.cn/）。

1.1.3 主要試劑及試劑盒。胎牛血清（貨號(hào)：SH30396.03）和RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：SH30809.01）均購(gòu)自Hyclone公司;CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：CK04）購(gòu)自日本DOJINDO 公司;改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：C503041）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備。

高通量組織研磨儀，Tissue Lyser Ⅱ，德國(guó)QIAGEN公司;酶標(biāo)儀，800TSNB，美國(guó)BioTek公司;二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，BC-J80SAB104-N，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;顯微鏡，BX53，日本奧林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。

復(fù)蘇胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116，采用RPMI1640培養(yǎng)基接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并置于5% CO2、 37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。

1.2.2 竹筍蛋白提取。

稱(chēng)取0.8 g竹筍，剪碎后平均分裝到3～4管2 mL離心管中，加10% PVPP（交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）和2顆5 mm磁珠，再加1.5 mL有SDS蛋白裂解液（含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%NP-40、20 mmol/L Tris，pH 8.0～8.5）、終濃度為1 mmol/L的PMSF（苯甲基磺酰氟）、2 mmol/L的EDTA，混勻，置于冰上5 min后，加入終濃度10 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇）。利用組織研磨儀Tissue Lyser Ⅱ 破碎組織（120 s，60 Hz），取出磁珠，4 ℃，15 000 r/ min×離心20 min。將全部上清液轉(zhuǎn)入新的50 mL離心管中，加入5倍體積的10%冷TCA（三氯乙酸）/丙酮，加入終濃度10 mmol/L DTT，搗碎沉淀于-20 ℃放置2 h或過(guò)夜，12 000 r/min，4 ℃、離心20 min，棄上清。將沉淀轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中，加1 mL冷丙酮，加入終濃度10 mmol/L DTT，搗碎沉淀，于-20 ℃放置2 h后，15 000 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清，重復(fù)此步驟，直至上清無(wú)色。風(fēng)干沉淀，加入適量有SDS 蛋白裂解液，加1顆5 mmol/L磁珠，采用Tissue Lyser Ⅱ 振蕩（120 s，40 Hz），4 ℃，15 000 r/min離心15 min，棄上清。加入終濃度10 mmol/L DTT，56 ℃水浴1 h。冷卻至室溫，加終濃度55 mmol/L IAM（碘乙酰胺），暗室放置45 min。加入5倍體積冷丙酮沉淀樣品2 h，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清。風(fēng)干沉淀，加入適量無(wú)SDS L3裂解液，加1顆5 mm磁珠，采用Tissue Lyser Ⅱ 振蕩（120 s，40 Hz）、4 ℃、15 000 r/min離心15 min，上清即為竹筍蛋白質(zhì)溶液。Bradford法測(cè)定蛋白液濃度，并分裝保存于-80 ℃。

1.2.3 竹筍蛋白孵育胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116。

將胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至60%～70%時(shí)將竹筍蛋白按0.02 mg/mL與培養(yǎng)基一起作用于上述細(xì)胞，72 h后顯微拍照，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

細(xì)胞用竹筍蛋白（試驗(yàn)前將竹筍蛋白用完全培養(yǎng)基按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50和1∶100的比例稀釋?zhuān)┨幚?2 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，混勻后培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

抑制率 =（1-竹筍蛋白作用OD值/陰性對(duì)照OD值）×100%。

1.2.5 IC50值（半數(shù)抑制率）的計(jì)算。采用GraphPad Prism 軟件，根據(jù)上述各梯度濃度的增殖抑制率，計(jì)算其IC50值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS v21.0（http：//spss.en.softonic.com/）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 12個(gè)竹種的分類(lèi)信息

為了探討不同竹種的竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116增殖的影響，選取了12個(gè)竹種進(jìn)行研究。根據(jù)1996《中國(guó)植物志》第9（1）卷，其分類(lèi)信息如表1所示[10]。

2.2 不同濃度竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

將不同濃度竹筍蛋白作用于人胃癌細(xì)胞SGC-7901 72 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖1所示，12種竹筍蛋白均可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越明顯;其中綠皮黃筋竹、撐綠竹3號(hào)、粉單竹、黃麻竹、吊絲單竹、馬來(lái)甜龍竹和勃氏甜龍竹的竹筍蛋白濃度與細(xì)胞增殖抑制率呈正相關(guān)關(guān)系，隨蛋白濃度的增加對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系;而桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹的竹筍蛋白到達(dá)一定濃度后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用趨于平緩。

2.3 不同濃度竹筍蛋白對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞增殖的抑制作用

將不同濃度竹筍蛋白作用于結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116 72 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖2所示，12種竹筍蛋白中均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的增殖，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越明顯;其中綠皮黃筋竹、撐綠竹3號(hào)、粉單竹、黃麻竹、吊絲單竹、馬來(lái)甜龍竹和勃氏甜龍竹的竹筍蛋白濃度與細(xì)胞增殖抑制率呈正相關(guān)，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系;而桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹的竹筍蛋白到達(dá)一定濃度后抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的增殖作用趨于平緩。

2.4 12種竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116增殖的影響

在一定濃度范圍內(nèi)，這12種不同種類(lèi)的竹筍蛋白均可抑制SGC-7901和HCT-116細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證這種抑制作用，將提取的稀釋成不同濃度的12種竹筍蛋白作用于SGC-7901和HCT-116細(xì)胞株72 h后，采用光學(xué)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，加以驗(yàn)證其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響。

從12種提取的竹筍蛋白原液稀釋5倍后作用于胃癌細(xì)胞株SGC-7901培養(yǎng)72 h后顯微鏡下的細(xì)胞生長(zhǎng)情況（圖3）可以明顯地看到，與CK對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)、結(jié)構(gòu)完整相比，12種竹筍蛋白作用于胃癌細(xì)胞株SGC-7901后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積縮小，胞核呈致密濃染，失去正常形態(tài)，呈半月?tīng)罨蛩閴K狀，表現(xiàn)為典型的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死狀態(tài)，尤其桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹，表明12種竹筍蛋白原液稀釋5倍后均可抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖，與CCK-8的檢測(cè)結(jié)果一致。

從12種竹筍蛋白原液稀釋5倍后作用于結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116培養(yǎng)72 h后顯微鏡下的細(xì)胞生長(zhǎng)情況（圖4）可以看出，與CK對(duì)照組相比，12種竹筍蛋白作用于結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積縮小，形態(tài)改變或細(xì)胞破碎，尤其桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹作用組表現(xiàn)出典型的細(xì)胞壞死狀態(tài)，表明12種提取的竹筍蛋白原液稀釋5倍后均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的增殖，與CCK-8的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.5 12種竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的半數(shù)抑制濃度

根據(jù)各不同梯度濃度的竹筍蛋白作用于腫瘤細(xì)胞的不同增殖抑制率，采用GraphPad Prism 軟件，計(jì)算IC50值，見(jiàn)表2。IC50值作為抑制能力的最終指標(biāo)，一般認(rèn)為，IC50值若2 ?mg/mL< 85%，則視為無(wú)效;若2 ?mg/mL≥85%或1 ?mg/mL>50%，視為弱效;若1 ?mg/mL≥85%或0.5 ?mg/mL>50%，則為強(qiáng)效抑制[11]。IC50的數(shù)值越小，說(shuō)明其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用越強(qiáng)。由表2可知，12種竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116增殖的抑制作用都屬于強(qiáng)效的;對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901抑制作用最強(qiáng)的是唐竹，其次是桂竹，然后依次是茶竿竹、斑竹、毛腳龍竹、吊絲單竹、馬來(lái)甜龍竹、綠皮黃筋竹、粉單竹、黃麻竹、撐綠竹3號(hào)，抑制作用最弱的是勃氏甜龍竹。對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116抑制作用最強(qiáng)的是毛腳龍竹，其次是桂竹，然后依次是斑竹、唐竹、茶竿竹、馬來(lái)甜龍竹、吊絲單竹、黃麻竹、撐綠竹3號(hào)、勃氏甜龍竹、綠皮黃筋竹，抑制作用最弱的是粉單竹。對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的增殖抑制作用均較強(qiáng)的竹種是桂竹、唐竹、毛腳龍竹、斑竹和茶竿竹。其他竹種的竹筍蛋白對(duì)這2種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用并無(wú)呈現(xiàn)出一定的種屬特異性規(guī)律。

3 結(jié)論與討論

12種竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的體外增殖均具有顯著的且強(qiáng)效的抑制作用，即具有抗癌活性。對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901抑制作用最強(qiáng)的是唐竹，其次是桂竹;對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116抑制作用最強(qiáng)的是毛腳龍竹，其次是桂竹;同時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116增殖的抑制作用表現(xiàn)均出色的是桂竹、唐竹、毛腳龍竹、斑竹和茶竿竹。

同一種竹筍蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的增殖抑制率不完全相同，并與竹筍蛋白的濃度密切相關(guān)。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白濃度越高其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用越明顯，即竹筍蛋白濃度與細(xì)胞增殖抑制率成正比，呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。而一些竹筍蛋白，如桂竹、斑竹、唐竹、毛腳龍竹和茶竿竹等在到達(dá)一定濃度后其抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用趨于平緩。

該研究中竹筍蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖都具有強(qiáng)效的抑制作用。一般認(rèn)為，腫瘤藥物敏感試驗(yàn)的體外試驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)化療療效總符合率達(dá)85%[12]，但仍需進(jìn)一步對(duì)竹筍蛋白進(jìn)行體內(nèi)的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)以及活性成分分析，確定其有效物質(zhì)成分。另外，該研究?jī)H僅探討了這12種竹筍蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116體外增殖的抑制作用，其對(duì)其他癌細(xì)胞株的增殖是否具有抑制作用尚不明確，以及其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制也不清楚，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討這些問(wèn)題。

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