來源于豆豉的枯草芽孢桿菌MX-6所產納豆激酶的穩定性研究

滿麗莉,向殿軍

(1.內蒙古民族大學 生命科學學院，內蒙古 通遼 028042；2.內蒙古民族大學 農學院，內蒙古 通遼 028042)

2008年世界衛生組織的報告顯示，每年有1730萬人死于心血管疾病，占全球年死亡總數的30%。血栓形成是導致心血管疾病的主要原因，其發病率和死亡率呈現逐年上升趨勢。納豆激酶(nattokinase)是日本傳統發酵食品納豆在發酵過程中由納豆芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌產生的一種有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，其具有很強的溶解血栓功能并可激活體內的纖溶酶原，活性是纖溶酶的4倍[1-3]，與目前臨床所用的鏈激酶、組織纖溶酶原激活劑、尿激酶等溶栓藥物相比，具有作用直接迅速、易被人體吸收、安全性好、藥效持續時間長、造價低廉、特異性高等優勢，納豆激酶將是一種很有潛力的新型溶栓藥物[4-6]。

穩定性是評價酶的重要參數之一，決定其工業化應用的可行性。納豆激酶的穩定性好，有利于降低成本，提升酶的催化效率和底物溶解度、降低酶用量。隨著納豆激酶應用范圍(如飼料、洗滌劑等)的不斷擴大，納豆激酶在生產過程中需耐受不同的熱環境、pH環境、金屬離子、化學物質等各種非自然條件，具有較好的穩定性顯得尤為重要[7-10]。本研究綜合分析了納豆激酶對熱、pH、金屬離子、化學物質、抑制劑和變性劑的穩定性及傳代穩定性，旨在為更合理地應用和開發納豆激酶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌MX-6(BacillussubtilisMX-6)：由中國豆豉中篩選鑒定獲得。

1.1.2 試劑及培養基

試劑：凝血酶，購自中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原和瓊脂糖，購自美國Sigma公司；其他藥品均為國產分析純。

基礎種子培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

基礎發酵培養基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器設備

SW-CT型超凈工作臺 鄭州南北儀器設備有限公司；MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋 北京天賜科儀商貿有限公司；BPH-9082型電熱恒溫培養箱 濟南來寶醫療器械有限公司；Microfuge16型離心機 美國貝克曼公司；WS-600型恒溫振蕩培養箱 德國Wiggens公司；DHP-600恒溫培養箱 常州中捷實驗儀器制造有限公司；110-801型三量ip67防水原點數顯卡尺不銹鋼零點電子游標尺 東莞市景有模具五金有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養方法及粗酶液制備

培養方法：挑取枯草芽孢桿菌MX-6接種于裝有50 mL基礎種子培養基的250 mL錐形瓶中，37 ℃、160 r/min條件下震蕩培養12 h(OD600=1.5～1.6)。

粗酶液制備：將培養的菌液按5%接種于裝有50 mL基礎發酵培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃，初始pH 7.2、160 r/min條件下震蕩培養72 h，制備成納豆激酶粗酶液。

1.2.2 納豆激酶活力的測定

發酵液以5000 r/min離心10 min，取10 μL上清液用于納豆激酶活性的測定。納豆激酶活力的測定采用纖維蛋白平板法[11]，溶圈直徑采用電子游標尺測定。

1.2.3 纖溶酶編碼基因aprN的擴增及鑒定

根據GenBank中已公布的纖溶酶編碼基因aprN序列，應用Primer軟件設計引物，上游引物：5'-GTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTC-3'和下游引物：5'-TCCGGTGCTTGTGAAGATTTTCAGA-3'用于擴增枯草芽孢桿菌MX-6中的aprN基因。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30次循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物運用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并測序。利用NCBI中的Blast及MEGA 6.0分別進行序列比對及系統進化樹構建。

1.2.4 納豆激酶的耐熱性研究

粗酶液于-20，4，30，37，40，50，60 ℃分別處理1 h，以4 ℃的處理為對照，按1.2.2的方法測定溶圈直徑，確定溫度對酶穩定性的影響。

1.2.5 納豆激酶的pH穩定性研究

粗酶液與Tris-HCl緩沖液按1∶1的比例混合，用0.2 mol/L NaOH將pH調至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，以pH 7.2為對照，4 ℃放置1 h后按1.2.2的方法測定溶圈直徑，確定pH對酶穩定性的影響。

1.2.6 金屬離子對納豆激酶穩定性的影響

粗酶液中分別加入不同的金屬離子(Mn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Hg2+、Ba2+)，終濃度為5 mmol/L，以不加金屬離子的粗酶液為對照，37 ℃處理18 h后按1.2.2的方法測定溶圈直徑，確定金屬離子對酶穩定性的影響。

1.2.7 化學物質對納豆激酶穩定性的影響

粗酶液中分別加入1%的牛血清蛋白、明膠、蛋白胨、丙二醇、乙醇、海藻酸鈉，以不加化學物質的粗酶液為對照，37 ℃處理18 h后按1.2.2的方法測定溶圈直徑，確定化學物質對酶穩定性的影響。

1.2.8 抑制劑和變性劑對納豆激酶穩定性的影響

粗酶液中分別加入0.1 mmol/L或1 mmol/L的PMSF(苯甲基磺酰氟)、1 mmol/L或10 mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、DTT(二硫蘇糖醇)、SDS(十二烷基硫酸鈉)，以不加抑制劑和變性劑的粗酶液為對照，37 ℃處理18 h后按1.2.2的方法測定溶圈直徑，確定抑制劑和變性劑對酶穩定性的影響。

1.2.9 納豆激酶的傳代穩定性研究

將枯草芽孢桿菌MX-6在基礎種子培養基斜面上連續傳代20次，培養溫度為37 ℃，培養時間為24 h。將不同代次的菌株按照1.2.1的方法培養并制備粗酶液，按1.2.2的方法測定溶圈直徑，觀察不同代次的菌種產酶活性變化情況，確定納豆激酶的傳代穩定性。

2 結果與分析

2.1 纖溶酶編碼基因aprN的擴增及鑒定

以枯草芽孢桿菌MX-6的基因組DNA為模板，應用aprN基因的特異性引物，PCR擴增獲得一條大小為1473 bp的特異性條帶(圖1)，測序結果與GenBank中已公布的枯草芽胞桿菌(CP017763.1、CP018184.1、CP014471.1)的aprN基因序列的同源性均達到99%以上，結果說明擴增基因序列的正確性。系統進化樹顯示枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶與納豆激酶E(WP 009966941.1)、納豆激酶NAT(WP 014479360.1)、納豆激酶前體(AA065246.1)聚合在同一分支上，表明枯草芽孢桿菌MX-6所產的纖溶酶為納豆激酶(見圖2)。

圖1 枯草芽孢桿菌MX-6的aprN基因的擴增Fig.1 Amplification of aprN gene in Bacillus subtilis MX-6

圖2 枯草芽孢桿菌MX-6的纖溶酶與同源纖溶酶構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of plasminogen in Bacillus subtilis MX-6 and homologous plasminogens

2.2 納豆激酶的熱穩定性

圖3 納豆激酶的熱穩定性Fig.3 Thermal stability of nattokinase

由圖3可知，粗酶液在-20，30～50 ℃處理1 h，酶活性基本不變(P>0.05)，但60 ℃處理1 h，發生嚴重失活(P<0.01)，說明納豆激酶在30～50 ℃熱穩定性較好。掌握納豆激酶的熱穩定性關系到酶的保藏、進入人體后的活性，該酶在人體溫度37 ℃左右、冷藏溫度4 ℃、冷凍溫度-20 ℃具有較好的穩定性，具有開發為溶栓藥物的基本條件之一。

2.3 納豆激酶的pH穩定性

圖4 納豆激酶的pH穩定性Fig.4 pH stability of nattokinase

酶的本質是蛋白質，酶的催化速度隨pH的變化而變化，不同的pH會影響帶電荷基團的解離狀態，進而影響酶的穩定性。由圖4可知，pH在3～11之間，酶活性相對穩定，由于人體的胃腸道是酸性環境，枯草芽孢桿菌MX-6所產的納豆激酶在酸性和堿性環境下均較為穩定，具有開發為腸溶劑的廣闊前景。

2.4 金屬離子對納豆激酶穩定性的影響

圖5 金屬離子對納豆激酶穩定性的影響Fig.5 Effect of metal ions on the stability of nattokinase

由圖5可知，Mg2+、Ca2+對納豆激酶的活性具有顯著的激活作用(P<0.01)，增強酶穩定性的主要原因可能有兩種：第一，可能與球蛋白的敏感部位結合，使酶的活性構象或結構更牢固；第二，可能屏蔽球蛋白表面的多余負電荷，消除其不利影響。K+、Fe2+對納豆激酶的穩定性基本無影響(P>0.05)，而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+對納豆激酶的穩定性具有極顯著的抑制作用(P<0.01)，Hg2+導致納豆激酶完全失活，Zn2+和Hg2+的加入分別導致絮狀物和大量沉淀的形成。結果與相關報道存在差異，可能是由于菌株或酶的不同所導致的。

2.5 化學物質對納豆激酶穩定性的影響

圖6 化學物質對納豆激酶穩定性的影響Fig.6 Effect of chemical substances on the stability of nattokinase

根據相關文獻報道，牛血清蛋白、明膠、蛋白胨、丙二醇、海藻酸鈉等有利于納豆激酶的穩定性[12]，而納豆激酶工業化生產的后道工序是開放式的，易發生雜菌污染而導致酶的降解，有必要檢測某些防腐劑如乙醇對酶穩定性的影響。由圖6可知，牛血清蛋白、明膠、蛋白胨能夠顯著提高納豆激酶的穩定性(P<0.01)，明膠>牛血清蛋白>蛋白胨，丙二醇、海藻酸鈉對納豆激酶的穩定性基本無影響(P>0.05)，而乙醇顯著降低納豆激酶的穩定性(P<0.01)。

2.6 抑制劑和變性劑對納豆激酶穩定性的影響

由圖7可知，PMSF為典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑，0.1 mmol/L或1 mmol/L的PMSF均可導致納豆激酶活性的完全喪失，說明枯草芽孢桿菌MX-6所產的納豆激酶是一種絲氨酸蛋白酶。1 mmol/L或10 mmol/L的EDAT對納豆激酶的活性基本無影響(P>0.05)，表明枯草芽孢桿菌MX-6所產的納豆激酶不是一種金屬蛋白酶。1 mmol/L或10 mmol/L的DTT對納豆激酶的活性基本無影響(P>0.05)，進一步說明納豆激酶結構中無二硫鍵的存在。1 mmol/L的SDS不會抑制納豆激酶活性(P>0.05)，而10 mmol/L的SDS顯著降低納豆激酶的穩定性(P<0.01)。

圖7 抑制劑和變性劑對納豆激酶穩定性的影響Fig.7 Effect of inhibitors and denaturants on the stability of nattokinase

2.7 納豆激酶的傳代穩定性

圖8 納豆激酶的傳代穩定性Fig.8 The generation stability of nattokinase

由圖8可知，各代菌株所產納豆激酶活性之間的差異不顯著(P>0.05)，納豆激酶發酵表現出穩定的遺傳性能，其納豆激酶生產性能基本保持穩定。說明納豆激酶生產菌株枯草芽孢桿菌MX-6具備作為工業生產納豆激酶出發菌株的前提條件。

3 結論

納豆激酶具有成本低、活性高、可口服、安全無毒等優點，已成為當今研究的熱點[13,14]。將納豆激酶開發成為口服溶栓藥物或腸溶劑，要求其具有良好的穩定性，亦是實現其工業應用的關鍵之一。枯草芽孢桿菌MX-6所產的納豆激酶在-20，4，30～50 ℃的熱穩定性較好；pH在3～11之間酶活性相對穩定；Mg2+、Ca2+對納豆激酶具有顯著的激活作用，K+、Fe2+對納豆激酶的穩定性基本無影響，而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+有顯著的抑制作用，Hg2+導致納豆激酶完全失活；牛血清蛋白、明膠、蛋白胨能夠顯著提高納豆激酶的穩定性，丙二醇、海藻酸鈉對納豆激酶的穩定性基本無影響，而乙醇顯著降低納豆激酶的穩定性；PMSF可導致納豆激酶活性完全喪失，EDAT和DTT對納豆激酶的活性基本無影響，10 mmol/L的SDS顯著降低納豆激酶的穩定性，納豆激酶活性具有良好的傳代穩定性。相關研究顯示不同納豆激酶的穩定性存在差異，這可能是由于所用菌株或發酵培養基及粗酶制備的方法不同造成的。準確掌握納豆激酶的穩定性有利于其生產、應用及保藏。