非培養方法研究榨菜中酵母菌的多樣性

燕平梅，邢勇，李娜，趙文婧，陳燕飛，喬宏萍

(1.太原師范學院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化綠色產業技術創新戰略聯盟，太原 030619)

榨菜越來越多地出現在人們的餐桌上，它是一種以莖用芥菜為原料腌制而成的半干態非發酵性咸菜，它質地脆嫩、風味鮮美、營養豐富，具有一種特有的風味，具有特殊的酸味和咸鮮味，富含豐富的人體所必需的蛋白質、胡蘿卜素、膳食纖維、礦物質等以及谷氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸等17種游離氨基酸，可以佐餐、炒菜、做湯，深受人們喜愛。在榨菜腌制過程中，酵母菌發揮了不可或缺的作用，可以將榨菜中的物質分解成人體易吸收的有益物質，通過研究榨菜中酵母菌的多樣性可以了解哪些種屬發揮的作用較大，然后通過人工添加相關菌種來促進榨菜的腌制。

本實驗中，研究榨菜中酵母菌的多樣性采用的是非培養的方法即PCR-DGGE技術，如今DGGE技術已經成為研究微生物群落及親緣關系的主要分子工具之一[1，2]，它具有不需要通過培養就可以進行分析序列的優點，可以大大地縮短樣品分析的時間，減少工作量，也已經廣泛地應用于食品(包括腌制蔬菜)微生物的研究中[3，4]。DGGE技術是通過聚丙烯酰氨凝膠中變性劑濃度的不同，將不同序列DNA分開，之后通過凝膠成像儀得到DGGE圖譜，通過DGGE圖譜上的條帶[5，6]，達到了解微生物的實驗目的，再通過對DGGE圖譜的分析，從而了解其種群特征及多樣性[7]。

榨菜在我國擁有悠久的加工歷史，并且由于其本身爽口的特點以及方便性，越來越深受人們喜愛，通過對榨菜進一步分析得知，不僅食材本身具有特殊性，其中微生物發酵對其口感也有影響，隨著對榨菜中微生物群落的多樣性研究越來越詳細，人們對口感的改善也有了更豐富的經驗，其中楊珺等[8]、李正國等[9]、燕平梅等[10]分別通過微生物的分離培養、傳統分離培養與DGGE技術結合、PCR-DGGE技術，對榨菜發酵過程中的微生物種類、榨菜腌制過程中的細菌多樣性以及榨菜中的乳酸菌群落進行了相關的研究，對細菌等微生物給出了參考。但是由于對榨菜中的真菌研究較少，故為了進一步探索榨菜中的真菌多樣性，本文通過PCR-DGGE技術對市售的袋裝榨菜進行了研究，進一步了解了榨菜中的真菌(以酵母菌為研究對象)群落的多樣性[11]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

爽口榨菜400 g，用SZ表示，其成分為：榨菜、食用鹽、辣椒、香辛料、食品添加劑(苯甲酸鈉、檸檬黃)；

烏江榨菜70 g，用WZ表示，其成分為：榨菜、食用鹽、植物油、食品添加劑(谷氨酸鈉、5-呈味核苷酸二鈉、安賽蜜、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉)、辣椒、發酵醬油粉(釀造醬油、麥芽糊精、食用鹽)。

1.1.2 主要試劑及儀器

試劑：血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、TAE緩沖液、 溴化乙錠、NLI-GC(引物)、 LS2(引物)、瓊脂糖(生化試劑)、無菌水、PCR Master Mix、丙烯酰胺、TAE buffer、TEMED、去離子甲酰胺、過硫酸銨、尿素、凝膠加樣緩沖液、氫氧化鈉、甲醛、冰醋酸、無水乙醇、硝酸銀。

儀器：離心機、超凈工作臺、PCR儀、凝膠成像系統、DYY-6C型電泳儀、電泳槽、紫外分光光度計 美國Bio-Rad公司；無菌手術刀、YXQ-LS-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器、水浴鍋。

1.2 榨菜中微生物的DNA提取

從兩種榨菜中各取榨菜汁18 mL于8000 r/min離心5 min，倒掉上清液，將菌種收集到離心管中，然后根據血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)的說明步驟提取DNA，最后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結果。

1.3 酵母菌的PCR擴增

以酵母菌的DNA為模板，引物為酵母菌的DNA擴增的通用引物(由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)：

NL1-GC:cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g；

LS2:att ccc aaa caa ctc gac tc；

PCR的反應體系為：PCR Master Mix 12.5 μL，NL1-GC 1 μL，LS2 1 μL，無菌水9 μL，樣品DNA 1.5 μL。

PCR的反應程序為：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,46 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,設置30個循環。

PCR結束后，取PCR產物5 μL，通過瓊脂糖凝膠電泳，觀察DNA電泳結果。

1.4 酵母菌PCR產物變性梯度凝膠電泳(DGGE)

變性梯度凝膠的配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 The formula of denatured gradient gel

DGGE電泳后凝膠于Bio-Rad公司的凝膠成像系統分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收，溶膠后作為模板通過PCR反應擴增16S rDNA V7-V8片段，純化后與pGM-T Vector進行連接， 轉化感受態細胞。將檢測陽性克隆的送至華大基因公司進行基因序列測定。

1.5 DGGE圖譜分析

將DGGE電泳片段放入凝膠成像系統中觀察并讀取圖譜，用Quantity One Software 對DGGE圖譜中條帶的亮度、位置、面積等數據進行分析，并對分析結果的數據進行標準化處理，然后根據Microsoft Excel軟件計算多樣性指數(H)、均勻度指數(E)及豐富度指數(R)。

其中相關生態指數計算公式為：

H=-∑Pilog2Pi；

E=1-∑Pi2；

R=S-1/InN。

式中：Pi為Relative Qty值/100，N為某一泳道所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數。

2 結果和分析

2.1 榨菜中微生物DNA提取結果

圖1 榨菜中微生物DNA瓊脂糖凝膠電泳結果 Fig.1 The result of microbial DNA in pickles by agar gel electrophoresis

注：圖中1,2 表示爽口榨菜，3，4表示烏江榨菜。

DNA瓊脂糖凝膠電泳結果中，條帶表示是否具有DNA，亮度表示其含量的多少。由圖1可知，在4個泳道中都有亮點，說明提取到了DNA，但是由于亮度較暗，說明DNA含量較少。

2.2 酵母菌PCR擴增結果

圖2中左邊第一條條帶為marker，其后4條條帶為酵母菌DNA，從左往右依次為SZ、SZ、WZ、WZ，根據Marker可知擴增后酵母菌DNA分子量為400 bp，可以進行DGGE分析。

圖2 酵母菌DNA PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoresis figure of Saccharomycetes DNA

2.3 酵母菌PCR產物變性梯度凝膠電泳

榨菜酵母菌的DGGE電泳圖見圖3。

圖3 DGGE電泳圖譜Fig.3 DGGE electrophoresis

圖3中SZ為爽口榨菜，WZ為烏江榨菜，圖中條帶的多少說明酵母菌種群的多樣性，不同位置的條帶說明酵母菌種屬不同，條帶的亮度表明酵母菌的豐富度[12，13]。爽口榨菜有兩條不同變性濃度的條帶，說明爽口榨菜中有兩種不同的酵母菌，烏江榨菜中也有兩種不同的酵母菌，但是爽口榨菜(SZ)中的第一條條帶與烏江榨菜(WZ)中的第一條條帶的變性濃度相同，說明這兩條條帶為同一種酵母菌。

2.4 DGGE圖譜結構多樣性分析

表1 榨菜中酵母菌多樣性分析Table 1 Analysis of the diversity of Saccharomycetes in pickles

由表1可知，樣品SZ(即爽口榨菜)中的酵母菌多樣性指數與豐富度都比樣品WZ(即烏江榨菜)中的數值大，均勻度卻比樣品WZ小。

2.5 聚類分析結果

圖4 樣本聚類分析結果Fig.4 Sample cluster analysis results

圖4中#1代表SZ，#2代表WZ，#3為空白位置，不帶有任何序列，根據聚類分析結果可知，SZ與WZ的相似性為0.60，說明在兩種榨菜中，酵母菌的相似性較大。

2.6 基因測序分析結果

表2 DGGE序列測序分析結果Table 2 Sequencing analysis results of DGGE sequences

編號SZ1代表爽口榨菜(SZ)DGGE圖譜中的第一條條帶，SZ2代表SZ中的第二條條帶，WZ2代表烏江榨菜(WZ)中的第二條條帶，由DGGE圖譜可知WZ中的第一條條帶與SZ1的變性濃度相同，可知為同一種酵母菌。由表2可以得出在NCBI中具有最高同源性的菌株，這有助于進一步準確確定其序列所屬的菌種，將測序結果使用MEGA 6.0軟件進行系統發育樹的構建，見圖5。

2.7 構建系統發育樹

圖5 DNA序列系統發育樹Fig.5 DNA sequence phylogenetic tree

由圖5可知，條帶SZ2與條帶WZ2有較近的親緣關系，相似度為93%；SZ2的相似菌種Candidatropicalis與WZ2的相似菌種Saturnisporamendonce的親緣關系較近，相似度高達98%；條帶生長SZ2與條帶SZ1親緣關系較差，相似度只有57%，由系統發育樹可知，兩種榨菜樣品中含有的酵母菌可能與Candidatropicalis，Pichiafermentans，Saturnisporamendonce這3種菌有較高的相似性。

3 討論

榨菜作為一種非發酵腌制食品，其中微生物種類豐富，越來越多的學者對其進行了深入研究，楊珺等在《四川榨菜后熟時期微生物區系的研究》中探索了其中細菌及真菌的優勢種類，得出酵母菌有5個屬，具體確定到種時為3種酵母菌，但是采用的方法為培養的方法，相對于本實驗采用的PCR-DGGE非培養方法較為麻煩，本實驗通過PCR-DGGE技術分析序列直接得知樣品中酵母菌的種類。隨后學者李正國對于研究榨菜中微生物多樣性的方法進行了前沿性探索，實驗采用培養方式及PCR-DGGE技術相結合的方法，得到了榨菜發酵中的優勢細菌為明串珠菌屬，其次為乳酸菌，雖然研究方法有了突破，但是研究的只是榨菜中細菌種類的多樣性，沒有涉及到真菌的研究，本文在其基礎上發展到對真菌的研究，在方法上只采用非培養PCR-DGGE技術進行研究[14]，本文以兩種市售榨菜為研究對象，對榨菜中的酵母菌多樣性進行了探索，由DGGE圖譜分析可知，酵母菌的種類含量較多，對于榨菜具有舉足輕重的作用。而DGGE技術檢測極限低，并且可以同時快速分析多個樣品，能清楚、準確地反映樣品間微生物群落的差異性及其多樣性，并且可以將條帶切割下來測序，可以說這是分析微生物群落多樣性及其差異性最為廣泛的工具之一[15]。本文得出的酵母菌種類與楊珺等人分析得出的酵母菌種類不同，不僅由于其樣本不同，可能還與DGGE分析有關，根據DGGE技術的原理可知，在同一位置上DNA序列是相同的，但是，由于異源雙鏈體[16]、嵌合體、共遷移等會導致結果產生偏差。在實驗操作中還應認真仔細，減少其不必要的誤差，如：DGGE電泳過程中的染色，應采用效果好且不與其他物質相影響的染色劑；還有在使用Quantity One軟件時應盡量減少偏差的出現，使其可以準確地體現出條帶的信息，這樣做出的實驗及得出的結論才可以有更高的精確性及說服力。所以可以采用其他方法，如原位雜交、克隆、分離培養等技術相結合使用進行分析，這樣可以提高實驗的準確性[17]。