百里香精油的提取工藝及化學(xué)成分分析

王娣，程柏，丁莉，任茂生

(蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香(Thymiherba)是百里香(ThymusmongolicusRonn.)植物的地上部分， 每年在夏秋季枝葉繁茂時(shí)采割，陰干后使用。百里香資源豐富，在我國(guó)主要分布在淮河以北、甘肅、陜西、寧夏等地[1-4]。我國(guó)古代著作《嘉祐本草》、《御制本草品匯精要》等書籍中均有記載[5,6]。現(xiàn)代研究表明百里香植株中含揮發(fā)油、黃酮類、多糖、三萜類等化學(xué)活性物質(zhì)，具有抗菌消炎、抗腫瘤等藥理作用[7-9]。同時(shí)百里香也是藥食同源植物，食品上常用于牛、羊肉除腥提鮮，是一種天然調(diào)味品，有較高的藥用和食用價(jià)值[10,11]。

超高壓技術(shù)作用效果快速、高效，是在常溫或較低溫度下，對(duì)物料迅速施加100～1000 MPa壓力，在食品活性成分提取、物料改性、滅菌、保鮮等方面有良好的效果[12-14]，可以應(yīng)用在植物精油、茶多酚、總黃酮、花色苷和紅景天苷等活性成分的提取上[15-19]。賈春曉等[20]利用超高壓萃取花椒精油，并對(duì)提取的精油進(jìn)行了化學(xué)成分分析；武艷梅超高壓提取柚皮精油，精油提取效果高效、節(jié)能；王娟等[21]采用超高壓、超聲波與微波輔助3種方法萃取茶樹花精油，發(fā)現(xiàn)超高壓精油提取率遠(yuǎn)高于超聲波法與微波輔助法，這些研究表明超高壓技術(shù)可以應(yīng)用在植物精油的提取上。本文利用超高壓法提取百里香精油，采用響應(yīng)面法對(duì)百里香精油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)提取的百里香精油化學(xué)成分進(jìn)行分析，為百里香資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

百里香：產(chǎn)于陜西省吳起縣，低溫烘干，粉碎過篩備用；無水乙醇：中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司；其他試劑：均為分析純。

XFB-200中藥粉碎機(jī) 吉首中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；HPP.L2B-600/0.6超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；MZKR022-R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；RE200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；CHR-ST冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Trace MS型氣相色譜-質(zhì)譜儀 美國(guó)Finnigan公司。

1.2 百里香精油的超高壓萃取工藝優(yōu)化

將備好的百里香粉10.0 g裝入聚乙烯袋中，加入一定體積的無水乙醇，真空密封；放入超高壓設(shè)備中，在一定壓力下進(jìn)行常溫保壓提取；提取結(jié)束后卸壓，在4000 r/min離心10 min得到上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行真空濃縮，濃縮液氮吹至無溶劑味，得到深棕黃色芳香精油，密封后于4 ℃冰箱中冷藏、備用。

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 超高壓壓力對(duì)百里香精油提取的影響

保壓時(shí)間4 min，料液比1∶30(g/mL)，粉碎度為50目，研究不同壓力(100，200，300，400，500 MPa)對(duì)百里香精油提取的影響。

1.2.1.2 料液比對(duì)百里香精油提取的影響

在400 MPa下，保壓時(shí)間4 min，粉碎度為50目，研究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)對(duì)百里香精油提取的影響。

1.2.1.3 保壓時(shí)間對(duì)百里香精油提取的影響

在400 MPa下，料液比1∶30(g/mL)，粉碎度50目，研究不同保壓時(shí)間(2，4，6，8，10 min)對(duì)百里香精油提取的影響。

1.2.1.4 粉碎度對(duì)百里香精油提取的影響

在400 MPa下，保壓時(shí)間4 min，料液比1∶30 (g/mL)，研究不同粉碎度(30，40，50，60，70目)對(duì)百里香精油提取的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert 8.0軟件以百里香精油提取壓力、料液比、粉碎度作為自變量，以百里香精油提取量為響應(yīng)值，建立回歸方程模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)因素和水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3 百里香精油成分GC-MS定性分析

氣相色譜儀條件：DP-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：初溫50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1。質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃，電離能量EI 70 eV，接口溫度250 ℃，掃描范圍15～450 nm。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 壓力對(duì)百里香精油提取的影響

圖1 壓力對(duì)百里香精油提取的影響Fig.1 Effects of pressure on the extraction of thyme essential oil

由圖1可知，百里香精油提取壓力在200～400 MPa時(shí)，百里香精油的提取量隨著壓力的增加而逐漸提高；當(dāng)提取壓力>400 MPa后，百里香精油提取量基本趨于穩(wěn)定。可能是超高壓在植物細(xì)胞內(nèi)外形成壓力差較大，植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，提高了溶劑擴(kuò)散動(dòng)力，因而有效成分的滲透速率也隨之提高，從而達(dá)到提取的效果；當(dāng)提取壓力>400 MPa時(shí)，細(xì)胞已被破壞，繼續(xù)增加壓力對(duì)精油提取效果的影響不大，因此綜合考慮，在優(yōu)化試驗(yàn)中選擇提取壓力400 MPa為宜。

2.1.2 料液比對(duì)百里香精油提取的影響

由圖2可知，料液比在1∶10～1∶50(g/mL)之間時(shí)，隨著料液比的增大，百里香精油提取量不斷增加并趨于穩(wěn)定；料液比<1∶30(g/mL)時(shí)，百里香精油提取量的增加幅度較大。料液比的增加能提高傳質(zhì)推動(dòng)力，加速百里香精油從植物細(xì)胞擴(kuò)散到液相中，但料液比增大到一定程度后，傳質(zhì)推動(dòng)力不再提高，百里香精油提取量趨于穩(wěn)定。綜合考慮，在優(yōu)化試驗(yàn)中選擇料液比1∶30(g/mL)為宜。

圖2 料液比對(duì)百里香精油提取的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of thyme essential oil

2.1.3 保壓時(shí)間對(duì)百里香精油提取的影響

圖3 保壓時(shí)間對(duì)百里香精油提取的影響Fig.3 Effects of holding time on the extraction of thyme essential oil

由圖3可知，保壓時(shí)間對(duì)百里香精油提取量的影響不大。壓力較高時(shí)，溶劑的滲透速率和溶質(zhì)的傳質(zhì)速率很大，細(xì)胞內(nèi)、外有效成分達(dá)到平衡所需的時(shí)間非常短，4 min后精油提取量增加不大，變化不明顯，進(jìn)一步延長(zhǎng)保壓時(shí)間并不能顯著提高百里香精油提取量；且保壓時(shí)間4，6，8 min沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.1.4 粉碎程度對(duì)百里香精油提取的影響

圖4 粉碎度對(duì)百里香精油提取的影響Fig.4 Effects of grinding degree on the extraction of thyme essential oil

由圖4可知，隨著百里香粉碎度的增加，百里香粒徑不斷減小，百里香精油提取量呈現(xiàn)先增后降后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)并略有下降，在50目時(shí)達(dá)到最大值。分析原因可能是隨著百里香粒徑的減小，比表面積逐漸增大，精油的擴(kuò)散速度隨之加快；若百里香粒徑過小，雖能提高浸提效果，但微粒的吸附作用也在加強(qiáng)，反而影響了精油的擴(kuò)散，使精油含量略下降。綜合考慮，在優(yōu)化試驗(yàn)中粉碎度選擇50目為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化百里香精油提取工藝結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取壓力、料液比、粉碎目數(shù)為百里香精油超高壓提取優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)因素，固定保壓時(shí)間為4 min。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。對(duì)此模型進(jìn)行回歸分析，見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，獲得超高壓提取百里香精油得率(mg/g)，對(duì)料液比(A)、壓力(B)、粉碎度(C)的二次回歸模型方程為：Y=11.15-0.19A+0.19B+0.16C-0.089AB-0.10AC-0.18BC-0.54A2-0.63B2-0.17C2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù) 表

注：“**”表示差異極顯著，P<0.01。

圖5 壓力和粉碎度的變化對(duì)百里香精油提取影響Fig.5 Effects of pressure and grinding degree on the extraction of thyme essential oil

由圖5可知，響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面，具有極高值，在一定范圍內(nèi)，百里香精油提取量隨著壓力和粉碎度的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；百里香精油提取量在壓力方向的曲線較粉碎度方向的更為陡峭，說明壓力對(duì)百里香精油提取影響更顯著，這與表3方差分析表一致。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由軟件分析得到最佳提取條件為壓力409.87 MPa，料液比1∶27.71，粉碎度54.93目，在此最優(yōu)條件下百里香精油提取量為11.2252 mg/g。結(jié)合實(shí)際操作得到提取條件為：壓力410 MPa，料液比1∶28，粉碎度50目，保壓時(shí)間4 min，提取溫度為室溫，得到百里香精油提取量平均值為11.236 mg/g。

2.4 百里香精油成分鑒定結(jié)果

用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)百里香精油進(jìn)行分析，得到百里香精油的GC-MS 總離子流圖，見圖6。由圖6可知，共分離出55種化合物，利用NBS75K 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)-計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)檢索，結(jié)合查閱質(zhì)譜手冊(cè)并與文獻(xiàn)核對(duì)，共鑒定出46種化合物，采用面積歸一化法測(cè)定各種成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。

圖6 百里香精油的GC-MS 總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of thyme essential oil

表4 百里香精油化學(xué)成分及含量Table 4 Chemical components and content of thyme essential oil

GC-MS鑒定出的46種化合物占總量的97.949%，含量在1%以上的化合物共14個(gè)，占總量的91.127%；含量在3%以上的化合物8個(gè)，占總量的77.912%；含量最高的是百里酚(43.925%)和對(duì)-聚傘花素(16.112%)，占總量的60.037%。從化合物類型來看，百里香精油所含成分主要為烯類、萜類、酚類、醇類、酯類，它們易揮發(fā)且呈現(xiàn)各自特殊的芳香氣味，構(gòu)成百里香精油的特色，如冰片具有類似胡椒和薄荷的香氣。從鑒定出的化合物相對(duì)分子質(zhì)量來看，較小相對(duì)分子質(zhì)量化合物占絕大多數(shù)，鑒定的化合物中，最小相對(duì)分子質(zhì)量為128，最大相對(duì)分子質(zhì)量為220，相對(duì)分子質(zhì)量為136，150，154，204的化合物最多，主要為帶環(huán)的烯烴類(單萜)；相對(duì)分子質(zhì)量為150 的化合物有8種，其中百里酚和香芹酚是百里香精油的主要成分，是含氧單萜的同分異構(gòu)體，百里香酚含量較高，占總量的43.925%，香芹酚較少，為2.655%，這兩種化合物含量的高低也是衡量百里香精油質(zhì)量的重要指標(biāo)。倍半萜類物質(zhì)有9種，它們的相對(duì)分子質(zhì)量為204，除石竹烯含量為2.870%外，其他物質(zhì)含量都不大，屬于百里香精油重要的尾香成分化合物。出峰較晚，相對(duì)分子質(zhì)量為220 的化合物有3種，其中氧化石竹烯含量較多，占總量的1.75%。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.0.6軟件，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超高壓百里香精油提取工藝，結(jié)合實(shí)際情況，確定最佳工藝條件為：壓力410 MPa，料液比1∶28，粉碎度50目，保壓時(shí)間4 min，提取溫度為室溫，得到百里香精油提取量平均值為11.236 mg/g。GC-MS鑒定出的46種化合物，其中百里酚和對(duì)-聚傘花素(16.112%)含量較高，分別占總量的43.925%和16.112%。