響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助離子液體提取黑豆花青素工藝研究

蘇適，于德涵，柴寶麗，遲彩霞

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061)

黑豆為豆科植物大豆的干燥種子，味甘性平，含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、纖維素、花青素、硒、磷、鐵多種微量元素和營(yíng)養(yǎng)成分[1]。此外，黑豆還含有多種具有生理功效的物質(zhì)，如黑豆紅色素、多糖和皂苷等。其中花青素是黑豆色素的重要成分，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生多余的自由基，對(duì)增加血管彈性、延緩機(jī)體衰老等都有一定的作用[2,3]。黑豆比黃豆有更高的醫(yī)藥價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景，花青素屬于類黃酮類的化合物，黑豆皮色素含量高，是一種天然、安全、健康的食用色素。

目前，采用浸提法提取花青素的應(yīng)用較多，但此法溶劑用量大、耗時(shí)長(zhǎng)、花青素得率較低[4]。超聲提取法在中草藥提取中應(yīng)用較多，利用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，破壞植物組織細(xì)胞[5]，加強(qiáng)成分的溶出和擴(kuò)散，將植物中的化學(xué)成分快速提取，提高產(chǎn)物的提取率，具有操作簡(jiǎn)單方便、耗時(shí)短、不破壞有效成分、提取液雜質(zhì)少等特點(diǎn)。離子液體(ionic liquid)是在室溫下完全由離子組成的液體物質(zhì)[6]。離子液體能夠吸收超聲波，可用于超聲輔助提取的天然產(chǎn)物的溶劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、不易燃燒、使用中揮發(fā)性低、提取過(guò)程萃取能力好、可重復(fù)利用等特殊性質(zhì)[7-9]，同時(shí)可以通過(guò)超聲或升高溫度等方法提高有效成分的提取率，保持其高溶解性和萃取能力[10]。采用離子液體-超聲輔助提取黑豆中花青素的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文運(yùn)用此方法，以黑豆皮為原材料提取花青素，資源廣泛，通過(guò)響應(yīng)面法得出最佳的提取工藝，同時(shí)研究黑豆皮花青素的抗氧化活性，為深入研究其應(yīng)用價(jià)值提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青仁黑豆，產(chǎn)地為黑龍江省。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；1-己基-3-甲基咪唑溴鹽(純度99%)：阿爾法試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

VGT-2013QT超聲波清洗器 廣州固特超聲儀器有限公司；XV-9200紫外分光光度計(jì) 北京市精密儀器廠；高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

顯色劑組成A∶B為1∶1。

A為甲醇溶液將1.0000 g 香草醛定容于100 mL容量瓶中；B為甲醇溶液將8.00 mL 濃鹽酸定容于100 mL容量瓶中。

采用香草醛-鹽酸法測(cè)定黑豆皮原花青素的濃度。精密稱取10 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精確量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL 容量瓶中，加入5.00 mL顯色劑，用1%的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度線，搖勻，在 30 ℃恒溫水浴中恒溫 30 min，在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以甲醇作為空白，以原花青素濃度(mg/mL)為X 軸，吸光度為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.9710X+0.0058，R2=0.9975。

1.3.2 黑豆皮花青素的提取

黑豆皮干燥到恒重，粉碎→ 過(guò)60目篩→ 準(zhǔn)確稱取1.0 g→加入離子液體乙醇溶液→超聲提取→離心30 min→測(cè)定上清液中花青素含量。

1.3.3 提取率計(jì)算

移取1.0 mL提取液，置于25 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，在530 nm 處測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中花青素濃度。

式中：C為花青素濃度(μg/mL)；V為定容體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)；M為黑豆皮質(zhì)量(g) 。

1.4 提取工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取黑豆皮1.0 g，采用離子液體-超聲輔助法提取黑豆花青素，考察離子液體濃度(0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mol/L)、超聲時(shí)間(15，25，35，45，55，65 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、提取溫度(20，30，40，50，60，70 ℃)對(duì)黑豆花青素提取率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了四因素三水平試驗(yàn)。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取離子液體濃度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)、提取溫度(D)，以黑豆花青素收率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化黑豆花青素提取工藝，以花青素的提取率為響應(yīng)值，建立響應(yīng)回歸模型，因素水平見(jiàn)表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of response surface experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 離子液體濃度對(duì)提取率的影響

圖1 離子液體濃度對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of the concentration of ionic liquid on extraction yield

由圖1可知，隨離子液體[Bmim]Br 濃度的增加，花青素的提取率逐漸變大，當(dāng)[Bmim]Br 濃度為0.8 mol/L 時(shí)，花青素提取率達(dá)到最大值，但隨著離子液體濃度繼續(xù)增大，提取率逐漸下降。原因可能與提取溶劑的黏度相關(guān)，離子液體的濃度過(guò)高，提取液黏度也會(huì)增大，提取劑的擴(kuò)散能力變差，難以滲到黑豆細(xì)胞的內(nèi)部，使得[Bmim]Br對(duì)黑豆花青素的溶出能力降低。因此，選擇離子液體[Bmim]Br 濃度為0.8 mol/L。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖2 提取時(shí)間提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield

由圖2可知，隨提取時(shí)間的不斷增長(zhǎng)，花青素提取率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，提取時(shí)間為45 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值，但時(shí)間超過(guò)45 min，提取率開(kāi)始降低。隨著提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，通過(guò)超聲波空化作用和機(jī)械震動(dòng)的持續(xù)作用，黑豆皮花青素向溶劑中逐漸溶出，提取率逐漸升高；但是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞組織中大量細(xì)胞破裂，增加了其他雜質(zhì)的溶出；同時(shí)，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞花青素的結(jié)構(gòu)，從而使提取率下降。因此，提取時(shí)間選擇45 min。

2.1.3 料液比對(duì)提取率的影響

圖3 料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction yield

由圖3可知，隨著料液比的增長(zhǎng)，花青素提取率逐漸增大，料液比為1∶50(g/mL)時(shí)，花青素提取率達(dá)到最大值，但料液比超過(guò)1∶50(g/mL)，花青素的提取率開(kāi)始下降。原因可能是黑豆皮的質(zhì)量一定，提取劑的料液比過(guò)小，離子液體有一定的黏度，不利于花青素在溶劑中擴(kuò)散，花青素向提取液轉(zhuǎn)移不完全；隨著料液比的增大，黑豆皮粉末在溶液中的分散程度增大，與提取液的接觸面積增大，有利于花青素的溶出；但大量溶劑會(huì)吸收一定的超聲波，降低了超聲波對(duì)細(xì)胞的破碎能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)花青素溶出減少，提取率下降；還可能因?yàn)橐掖己蚚Bmim]Br與花青素分子上的羥基之間存在氫鍵作用，隨著料液比的不斷增大，氫鍵作用逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致花青素的提取率降低。因此，料液比選擇1∶50(g/mL)。

2.1.4 提取溫度對(duì)提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花青素提取率逐漸增大，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，提取率最大，但溫度繼續(xù)升高，提取率出現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)。原因可能是隨著體系的溫度升高，離子液體的運(yùn)動(dòng)速率和頻率也不斷變大，使其更容易滲透到黑豆皮組織細(xì)胞中，加速花青素的溶出，從而增加花青素的提取率。但繼續(xù)升高體系的溫度，過(guò)高的溫度會(huì)使花青素結(jié)構(gòu)上的酚羥基發(fā)生氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)被破壞；也可能因?yàn)殡S著溫度升高，細(xì)胞中其他內(nèi)容物溶出增多，導(dǎo)致溶液黏度增大，影響花青素向外溶出，從而使提取率下降。所以，選擇提取溫度50 ℃。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 2 Design scheme of response surface test

續(xù) 表

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次回歸擬合方程Y=4.21+0.084A+0.039B+0.080C-0.017D-0.025AB+2.750E-003AC-0.027AD-0.020BC+0.023BD-0.020CD-0.37A2-0.17B2-0.10C2-0.20D2。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

續(xù) 表

注：P>0.05為不顯著；P<0.05為顯著；P<0.01為極顯著。

對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由表3可知，P<0.0001，說(shuō)明數(shù)據(jù)模型方程達(dá)到極顯著水平；失擬值P=0.9972>0.05，無(wú)顯著差異，說(shuō)明回歸方程與試驗(yàn)擬合良好，誤差小。回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，回歸模型一次項(xiàng) A，B，C為模型極顯著因素，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2為模型極顯著因素，其余各項(xiàng)對(duì)黑豆皮花青素得率影響均不顯著。因此，可用此模型對(duì)黑豆皮花青素提取工藝和提取率條件進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面圖可以顯著反映各因素之間相互作用的強(qiáng)弱，采用Box-Behnken 軟件對(duì)響應(yīng)曲面圖進(jìn)行分析，可以得到各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。如果響應(yīng)曲面較陡峭，說(shuō)明該因素對(duì)花青素得率的影響較大，響應(yīng)值對(duì)于提取條件的改變就越敏感；如果響應(yīng)曲面相對(duì)平緩，說(shuō)明該因素的波動(dòng)對(duì)響應(yīng)值的影響較小。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface figures of the interaction of various factors

由圖5可知，離子液體濃度與提取溫度之間交互作用的響應(yīng)曲面最陡峭，對(duì)響應(yīng)值影響最顯著；離子液體濃度與提取時(shí)間之間交互作用的響應(yīng)曲面相對(duì)陡峭，說(shuō)明對(duì)響應(yīng)值影響顯著程度次之；提取時(shí)間與提取溫度、提取時(shí)間與料液比、料液比與提取溫度、離子液體濃度與料液比的交互作用對(duì)提取率的影響顯著程度逐漸減小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，響應(yīng)值無(wú)顯著性變化。可知影響黑豆皮花青素提取率的各交互作用因素順序?yàn)锳D>AB>BD>BC>CD>AC。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)，分析回歸模型，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，最終得出該提取方法準(zhǔn)確可靠、可行。黑豆皮花青素的最佳提取條件：離子液體濃度0.93 mol/L，提取時(shí)間45.39 min，料液比1∶50.96，提取溫度43.94 ℃，理論預(yù)測(cè)值4.1291 mg/g。結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況，最終選擇離子液體濃度0.9 mol/L，提取時(shí)間45 min，料液比1∶51，提取溫度44 ℃，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，得到花青素提取率平均值為4.118 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，驗(yàn)證了此模型的有效性，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型與實(shí)際情況擬合較好。

2.3 與傳統(tǒng)提取法的比較試驗(yàn)

為了對(duì)比傳統(tǒng)提取方法和離子液體對(duì)黑豆皮的提取效果差異，分別采用乙醇加熱回流法、乙醇超聲輔助提取法和[Bmim]Br的離子液體超聲輔助提取法在優(yōu)化的條件下對(duì)花青素進(jìn)行超聲波輔助提取。由表4可知，離子液體超聲輔助法提取黑豆花青素的提取率均高于普通溶劑。離子液體對(duì)天然成分提取的優(yōu)勢(shì)是由于有機(jī)陰離子對(duì)植物纖維素有極強(qiáng)的溶解性，能極大破壞植物細(xì)胞壁，并通過(guò)氫鍵、色散力、范德華力等方式結(jié)合活性成分，使天然成分更容易溶出。在超聲波輔助作用下，超聲的空化效應(yīng)能加速離子液體穿透植物組織，促進(jìn)植物組織內(nèi)的黑豆花青素溶出，同時(shí)[Bmim]Br可能作為一種載體將黑豆花青素從植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)，從而提高了黑豆花青素得率。

表4 離子液體與傳統(tǒng)溶劑的比較Table 4 Comparison of ionic liquid with traditional solvent

3 離子液體的回收

由于[Bmim]Br離子液體的密度大，沸點(diǎn)高，提取后的離子液體中加入與其不互溶的乙酸乙酯來(lái)分離花青素，分離出與乙酸乙酯不互溶的離子液體，再減壓蒸餾蒸除水分，再在真空烘干箱中65 ℃烘干，對(duì)分離出的離子液體進(jìn)行吸光度測(cè)定，回收的離子液體吸光度值與未使用過(guò)的離子液體吸光度值接近。采用回收的[Bmim]Br離子液體進(jìn)行重復(fù)提取，進(jìn)行 3 次平行試驗(yàn)，提取率達(dá)到首次提取率的92.55%，因此，可再重復(fù)利用進(jìn)行提取。

4 結(jié)論

本研究采用離子液體-超聲輔助提取法，對(duì)黑豆皮花青素的提取工藝進(jìn)行了研究。根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝條件為：離子液體濃度0.9 mol/L、料液比 1∶51(g/mL)、提取溫度44 ℃、超聲時(shí)間 45 min，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)；在此條件下黑豆皮花青素的提取率可達(dá)4.118 mg/g。離子液體的極性可控，可以對(duì)中藥中的復(fù)雜成分進(jìn)行選擇性提取，與傳統(tǒng)提取工藝相比，該提取工藝時(shí)間短，所需溶劑少，離子液體可重復(fù)利用。本文采用離子液體超聲輔助提取黑豆皮中花青素，獲得較優(yōu)提取工藝參數(shù)，可為深層次開(kāi)發(fā)天然色素的研究提供理論依據(jù)，有益于黑豆皮花青素在食品工業(yè)上的推廣與應(yīng)用。