納豆激酶活性和穩定性的研究進展

于瀟瀟，杜慧聰，商鶴琴，馬領領，李靳影，苑寧

(河北農業大學 理工學院，河北 滄州 061100)

納豆，是以黃豆為原料經過浸泡、高溫蒸煮后與納豆菌接種培養的一種健康食品，是日本飲食中必不可少的調味品之一，也是日本一種廣受人們喜愛的風味物質。其經發酵后大豆中的不溶性蛋白變成可吸收的氨基酸，且含有納豆激酶、納豆異黃酮、皂青素、維生素K2等多種功能因子，具有幫助腸胃消化吸收、降低血脂、軟化血管、預防高血壓及動脈硬化的作用，還兼具緩解骨質疏松、解酒等功效[1]，日常食用可維護人體正常機能。納豆活性因子中的納豆激酶是近年來炙手可熱的溶血栓類藥物，其較高的纖溶活性引起了科學家的廣泛關注，但納豆激酶3D結構極易受外界因素影響[2]，在加工貯藏過程中損耗嚴重而使納豆激酶的纖溶作用大大降低，本文歸納了物理、化學、生物三大類因素對納豆激酶活性及穩定性的影響，旨在為納豆激酶的研究提供可靠的理論支撐，給納豆激酶類產品的開發及應用奠定堅實的基礎，以尋求更優良的加工工藝及貯存方法。

1 結構和作用機理

1.1 納豆激酶的結構

納豆激酶是枯草芽孢桿菌代謝時產生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，分子內無二硫鍵，固體呈白色或淡黃色，可溶于水。納豆激酶的DNA序列由275個氨基酸殘基構成，相對分子質量約為28000 Da，等電點pH為8.6±0.3，該酶的N末端為丙氨酸。NK的3D結構見圖1，根據晶體3D結構分析可知，NK含有7個α-螺旋、9個β-折疊和2個Ca2+結合位點(位點A和位點B，2個位點均位于NK球狀結構的表面)以及3個Trp、12個Tyr和3個Phe。經研究發現NK的活性中心由催化三聯體(Asp32、His64、Ser221)、氧離子洞(Asn155)和底物結合位點(Ser125、Leu126和Gly127)組成，位于NK球狀蛋白表面的溝槽內[3]。

圖1 納豆激酶蛋白的3D結構圖Fig.1 Three-dimensional structure of nattokinase protein

1.2 納豆激酶的作用機理

1.2.1 溶栓作用

經研究發現納豆激酶的溶栓活性是纖溶酶的4倍，溶栓速度是尿激酶的19倍之多。納豆激酶一方面可水解纖溶蛋白生成小肽和氨基酸直接進行溶栓，另一方面通過穿透腸壁刺激血管內壁產生內源纖溶酶原激活劑，起到雙重溶栓作用[4]。納豆激酶也能將體內的尿激酶原轉化為尿激酶[5]，從而激活纖溶酶原產生纖溶酶,增加內源纖溶酶,以溶解血栓。通過降解和失活纖溶酶原激活劑的抑制劑(PAI-1)達到溶栓作用，也是納豆激酶溶解血栓的一種途徑。納豆激酶溶栓機制見圖2，有動物實驗研究顯示納豆激酶也可在體外將血栓溶解。

圖2 納豆激酶溶栓機制示意圖Fig.2 Schematic diagram of thrombolytic mechanism of nattokinase

1.2.2 降血壓

須見洋行博士在1998年的大鼠實驗中首次證實納豆激酶提取物有降血壓的功效，Murakami等進一步研究證實具有降血壓作用的并非納豆激酶，而是高溫作用后的納豆激酶酶蛋白裂解產生的小片段肽LY和FY，這兩個小片段肽通過抑制血管緊張素轉換酶，控制血管收縮和舒張，緩解高血壓癥狀[6]。

1.2.3 降血脂、抗動脈粥樣硬化

NK可通過直接抗氧化作用，減少脂質過氧化程度，改善脂質代謝，降低血脂，同時防止動脈粥樣硬化現象的發生。Park K J等的動物實驗證實NK能顯著降低總膽固醇、血清甘油三酯和LDL膽固醇水平[7]。NK通過溶栓作用清除血塊，減緩斑塊形成的進程；通過降壓作用調節血液流通速度；通過降脂作用，防止脂質氧化，從而逆轉動脈粥樣硬化病變，凈化血液環境。也就是說NK抗動脈粥樣硬化、改善血液環境的功效是抗血栓、抗凝、抗氧化和降脂的綜合作用[8]。

1.2.4 保護神經

人體的多種疾病與淀粉樣蛋白有關，比如阿爾茨海默病，納豆激酶通過溶解淀粉樣蛋白延緩老年人腦衰老進程。Hsu等研究發現，除了纖維蛋白，納豆激酶還可以在中性pH和正常體溫下溶解淀粉樣蛋白，這一點在最近一項體內和體外模型研究中得到證實，同時數據表明NK兼具蛋白水解、抗炎和抗凋亡的功效，關于更多納豆激酶對神經類疾病的預防和治療有待進一步研究[9]。

1.2.5 其他作用

納豆激酶的抗凝血作用是由于納豆激酶可以抑制膠原活化血小板中血栓烷B2的形成，在一項NK和阿司匹林抗血小板凝集作用比較的研究中，NK在體內外均顯示出優異的抗血小板凝集和溶栓能力，無副作用，可作為阿司匹林類藥物的替代品。早先有報道稱NK在骨質疏松和糖尿病的預防和治療中起一定作用，南京醫科大學學報中指出納豆激酶可以誘導玻璃體后部脫離，延緩視網膜中央動脈靜脈阻塞，有效改善視網膜功能，可應用于眼部玻璃體溶解術中，目前這些作用機理研究尚未成熟，有待進一步考證。

2 影響NK活性及穩定性的因素

2.1 物理因素

2.1.1 溫度

納豆激酶本質為蛋白質，其活性和穩定性極易受溫度的影響，37 ℃以下納豆激酶的穩定性較好，平均酶活可達到93%，47～60 ℃環境下相對酶活可保持在95%以上，其中55 ℃時酶活達到峰值，高于該溫度后，活性隨著溫度的升高而逐漸降低，當溫度超過60 ℃時，納豆激酶會立即變性失活。由此可見高溫對酶活性的影響較大，但低溫貯存對于納豆激酶的品質影響不明顯，肖美燕等人在實驗中證實反復凍融對納豆激酶的活性影響不大，反復凍融8次，活力仍達到78%以上，另有報道納豆激酶在-20 ℃下保存7天，酶活力基本不變，由此可見低溫儲藏納豆激酶不失為一種良好的保藏方法[10]。

2.1.2 干燥處理

傳統的納豆食品保質期短，不利于儲存食用，將納豆進行干燥處理可有效延長其貨架壽命，減少食用人群對納豆拉絲的厭惡感，同時營養成分流失較少，對于納豆食品不失為一種有效的保藏方法。用于保藏食品常見的干燥技術有真空冷凍干燥、噴霧干燥、鼓風干燥、分段聯合干燥等[11]。

諸多實驗證實真空冷凍干燥可有效地保護納豆激酶的穩定性和活性，曹峰等通過深入探究冷凍干燥工藝條件得到最優技術，凍干后其酶活高達81.8%[12]。除此之外，在干燥過程中添加保護劑(蔗糖5%、麥芽糊精3%、脫脂乳粉10%、抗壞血酸0.5%)使得納豆激酶的酶活保持率提高了69.8%，弓玉紅等對曹峰的實驗進行了優化，得出當用5%甘油、0.5%抗壞血酸、5%檸檬酸鈉做保護劑時納豆激酶酶活更高[13]。但冷凍干燥技術存在能耗大、投入成本過高的弊端，在納豆制品的干燥制備中較少利用。噴霧干燥技術因干燥效果高，易改變干燥條件且對干燥材料無特殊要求而受到廣泛關注，但經處理過的納豆激酶酶活較冷凍干燥降低約2/5，因此在之后的研究中找尋可提高酶活的保護劑至關重要。鼓風干燥技術經濟適用度高但效率低，其中熱鼓風干燥對納豆激酶活性和穩定性的損耗最為嚴重。近幾年分段聯合干燥技術的研究方興未艾，分段聯合干燥技術是指根據物料的特性，使用2種及2種以上干燥方式優勢互補,分階段進行的一種復合干燥技術，可使食品良好的風味、色澤及營養物質得以保存，同時減少干燥過程中的能耗，避免了單一干燥方式的缺點。此干燥方法現已被大量應用于果蔬加工中，今后應以納豆激酶的特性為出發點探究合適的聯合干燥技術進一步優化工藝條件，確定出納豆激酶的最適宜干燥方式，為納豆激酶類產品貨架期的提高提供技術支撐。

2.1.3 物理包埋

物理包埋是一種常用的保藏食品的技術，其原理是將目的物用天然的或者合成的大分子化合物薄膜完全包封，而對目的物的物理化學性質并無損害的技術。孫建華等人利用海藻酸鈉、羧甲基纖維素、CaCl2對納豆激酶進行包埋，使得納豆激酶的酶活得以保持[14]。另有Dong Xuyan等以卵磷脂、植物甾醇和甘露醇等為輔料及張杰等利用阿拉伯膠和明膠等實現了對NK的有效包埋，且經實驗數據可知包封后的納豆激酶可在高溫低pH下維持自身的穩定性和活性[15]。Law D等進一步研究將NK制成片劑后在表面涂上腸溶性的包衣材料，其在400 MPa的壓力和極低pH下都不會變性[16]，Wei Xuetuan等用甲基丙烯酸-乙烷基丙烯酸鹽共聚物對納豆激酶進行包埋，使納豆激酶在酸性條件下被保護而免于變性失活[17]。物理包埋使得納豆激酶不受外界因素影響且包埋后的NK可以更有效地在小腸當中被利用，這些研究都為納豆激酶類藥物的研發提供可參考的應用實例。

2.2 化學因素

2.2.1 pH

pH對納豆激酶活性和穩定性的影響研究較為透徹，在pH 7.0～10.0范圍內納豆激酶具有良好的穩定性，當pH<5.0時納豆激酶極不穩定。pH在7.0～9.0時納豆激酶活性較高，在pH為8.0時酶活性最高，另有實驗指出pH在8.5時酶活最高，可能是因為納豆激酶純度或其他條件的影響而稍有偏差。當pH降到7.0以下時，納豆激酶活性急劇下降，當pH升到10.0以上時，酶活雖有所降低但不明顯，證明納豆激酶在堿性條件下穩定性好，可在堿性條件下進行儲存利用。

2.2.2 金屬離子

納豆激酶的活性受多種金屬離子的影響,牟小超等通過改良的四肽底物法得到經Ca2+和Tb3+處理的納豆激酶酶活性得到顯著提高，其中Ca2+的效果最好。Cu2+、Co2+和Mn2+產生了不同程度的抑制作用，其中Cu2+作用下的NK只保留了12%的酶活。但實驗也同時顯示金屬離子與NK結合后擁有更好的穩定性，可能是結合后蛋白表面的靜電相互作用減小，使得形成更穩定更緊密的結構。另有報道稱Hg2+會使納豆激酶完全喪失活性，而后的實驗中發現Fe2+也具有極強的抑制作用；Na+、Cl+等對納豆激酶活性穩定性幾乎無影響，但高濃度的NaCl對納豆激酶活性有較強的抑制作用。曲濤等利用金屬離子對納豆激酶進行化學修飾，經Mg2+修飾后的納豆激酶穩定性得到了大幅提高，熱穩定性提高了46%，酸堿穩定性提高了51%[18]。在今后納豆激酶類產品的研究中可適當添加金屬離子對產品進行優化，以保證產品在運輸、保藏、食用中發揮更好的效力。

2.2.3 保護劑

添加保護劑是現今維持物質活性和穩定性的重要手段，陳晨等將葉酸分子與殼聚糖鏈鍵接制備成保護劑后加入納豆激酶的溶液中，使得納豆激酶的β-折疊解聚，二級結構以α-螺旋為主，經此轉變后的納豆激酶活性和穩定性都得到了顯著提高[19]。Nie等人利用蔗糖酯、羧甲基纖維素鈉和明膠作為聯合保護劑提高了納豆激酶乳制品的穩定性[20]。Zhang Shaofei等人用多臂聚乙二醇-聚谷氨酸肽樹狀大分子作為納豆激酶保護劑，不僅維持了納豆激酶的穩定性且活性損失較小。Wu等人將采用發散-收斂法合成的聚賴氨酸樹狀大分子(PLLD)添加到納豆激酶中，獲得了高達117%酶活的結合體，而且在不同溫度和pH下比游離的NK更穩定[21]。另有實驗測得牛血清蛋白、海藻酸鈉、蛋白胨、甘油、丙二醇、明膠等物質與納豆激酶混合后，均能提高納豆激酶的熱穩定性，其中添加明膠后酶的穩定性顯著提高。關于納豆激酶保護劑的研究如火如荼，科學家們正致力于調配出能提高納豆激酶活性并穩定性良好的新型保護劑。

2.2.4 膳食成分

納豆激酶在低pH下耐受性差，在抵達小腸發揮作用之前會在胃部損失一部分活性，而在進食納豆激酶時如同時有蛋白質、淀粉、油脂等膳食的參與，會減少納豆激酶的損失，原因可能是膳食纖維對蛋白的保護作用，例如煮沸的小麥或大米的提取液、肉湯等都能顯著提高納豆激酶的穩定性。張星燦將納豆激酶與腐乳湯汁共存，得出在香辛料條件下保存70 d相對酶活率仍可保持在73.4%以上，香辛料不僅可以維持納豆激酶的活性和穩定性，而且消除了NaCl、乙醇對納豆激酶的抑制作用，證實了納豆激酶腐乳產品的可行性[22]。今后的研究可通過向片劑或口服液中添加膳食纖維，一方面可增加營養物質的攝入，另一方面可保證納豆激酶的作用能效。還可將納豆激酶與常用調味品結合添加其他輔料進行新產品開發，在某種程度上提高了大眾對納豆激酶類產品的可接受度。

2.3 生物因素

2.3.1 基因突變

外界因素對納豆激酶活性和穩定性的影響歸咎于對其結構的影響，通過生物手段誘導納豆激酶結構變化提高納豆激酶活性和穩定性的研究近年來如火如荼。劉中美等的實驗研究了個別氨基酸突變對納豆激酶穩定性的影響，結果表明氨基酸位點N76D、P14L突變能提高納豆激酶的穩定性，但在進一步研究中發現該突變體酶活只有原來的70%[23]。趙菡等將納豆激酶表面的Asn和Gln突變為Asp和Glu后,得到活性提高為原來1.54倍的突變體Q59E以及熱穩定性增強的突變體N218D，其中雙突變體Q59E-N218D除熱穩定性得到提高外，酶活接近原始酶水平[24]。改組技術是生物誘導基因突變常用的研究技術，蔡永君通過改組技術將納豆激酶、枯草桿菌蛋白酶等3種酶蛋白編碼基因進行重組后轉化入大腸桿菌，得到納豆激酶活性、催化效率均提高2.1倍的突變體[25]。宋文超對先前紫外線誘導酶活提高了258%的納豆芽孢桿菌BSN-3進行進一步誘導，得到酶活最高的A10-5菌株[26]。基因突變存在著隨機性、不定向性、低頻性的特點，導致納豆激酶突變體的活性和穩定性良莠不齊，對納豆激酶的研究造成嚴重困擾，研究人員正努力探索酶活更高、穩定性更好的納豆激酶突變體。

2.3.2 混合菌種發酵

納豆激酶是大豆發酵后產生的獨特功能因子，但因納豆類似干酪的氣味而不受人歡迎，高沛汝嘗試將納豆芽孢桿菌和釀酒酵母進行共發酵，發酵后產物帶有淡淡酒香而較容易被接受，且經實驗測得納豆激酶酶活提高了44.48%[27]。彭冬英等人利用納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發酵得到的產物活性較之前提高了64.18%，王瑞珍等將納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發酵成功得到了活性提高70.42%的核桃粕發酵品納豆激酶，同時賦予了更多的營養物質[28，29]。王常蘇等將納豆枯草芽孢桿菌和毛霉混合發酵順利提高酶活，更值得一提的是發酵后的納豆產品基本無氨味[30]。高澤鑫等人隨后又優化了上述方案，選取納豆枯草芽孢桿菌BN-05和毛霉菌MS-7共發酵，進一步提高了酶活[31]。沈陽農業大學學報還報道了沼澤紅假單胞菌與納豆芽孢桿菌混合發酵的實例[32]，其發酵后納豆激酶的穩定性得到了很好的增強。由此可見混合菌種發酵不僅提高了納豆激酶的穩定性和活性，還改善了傳統納豆發酵品的風味，此外增添了其他營養物質，使納豆更容易被人們感官所接受，是改良納豆風味、提高NK酶活增強穩定性的好方法。

3 展望

近年來，血栓疾病嚴重地威脅著人們的生命健康，因血栓疾病而死亡的人數將近世界總死亡人數的1/4，且數據呈現上升趨勢。目前臨床所用溶血栓藥物存在著出血、給藥痛苦等副作用，而且大多數價格昂貴，因此尋求高效、無副作用、價格低廉的新型溶血栓類藥物亟待解決。近幾年關于納豆激酶溶血栓作用的研究多不計數，納豆激酶類保健食品也層出不窮，納豆激酶可通過多種途徑進行高效溶栓，且兼具可口服、安全性高、無副作用、價格低廉和纖溶活力強等優勢，目前已有多家公司成功生產上市納豆激酶類產品。納豆激酶屬于大分子化合物，在保藏過程中極易失去活性，作為溶血栓制劑來說，納豆激酶在到達作用位點之前必須保持良好的活性和穩定性，目前研究通過篩選納豆激酶菌種，改進發酵工藝，利用現代基因工程技術和誘變育種技術，對酶活性位點、氨基酸定向進化等手段提高納豆激酶的活性和穩定性以及產量。在工業化生產中，采用物理包埋、納米粒子結合以及控制溫度、pH、共存物質等工藝對納豆激酶進行優化，豐富和改良了納豆產品的保健功效，提升了納豆激酶作為溶栓劑的開發應用前景，對預防和治療血管栓塞性疾病具有重大意義。

未來應更重視納豆激酶類藥品和保健品的開發，為廣大人們的生命健康保駕護航。