磁性納米顆粒標記間充質干細胞及對其功能的調控

馬思雨，王 鵬，楊玉志，孫劍飛，顧 寧

(1.東南大學生物科學與醫學工程學院 江蘇省生物材料與器件重點實驗室 生物電子學國家重點實驗室，江蘇 南京 210096)(2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 臨床醫學工程處，江蘇 南京 210008)(3.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 運動醫學與成人重建外科，江蘇 南京 210008)(4.蘇州納米科技協同創新中心，江蘇 蘇州 215123)

1 前 言

干細胞是一類具有自我更新能力并能夠進行分化的多功能細胞，將干細胞移植到體內后可以實現組織或器官的再生[1]。干細胞主要通過分化成為目標組織、用于基因治療、通過旁分泌改善微環境等幾種方式進行組織修復或器官再生[1]。干細胞治療是目前組織修復領域最有前景的治療方法之一，但是對干細胞移植后分布、活性、分化方向、作用機制等認知的缺乏，成為制約干細胞治療進一步研究的主要瓶頸。目前運用一些方法可以對移植到體內的干細胞的分布、活性等情況進行檢測，例如用磁性納米顆粒標記干細胞后，利用磁共振成像技術(magnetic resonance imaging,MRI)有望實現體外無創、實時、安全、有效的長期示蹤觀察和檢測。磁性納米顆粒具有生物可降解、溫和無毒的性質，并且可以通過調節粒徑調控磁性[2]，磁性納米顆粒在干細胞研究中主要作為磁共振比對劑，應用于干細胞示蹤，且磁性納米顆粒的MRI成像技術具有靈敏度高、副作用較少、可降解、體內留存時間長、毒性低等優點[3]。但目前標記的干細胞在體內死亡、裂解后釋放的氧化鐵納米顆粒能否造成非特異成像目前尚未定論；且由于氧化鐵納米顆粒不能隨細胞的分裂而進行自體復制，所以在監測移植后干細胞的增殖和分化方面存在一定不足[4]。常見的納米顆粒標記干細胞的方式有兩種，一種是將納米顆粒依附于細胞表面，另一種是細胞將納米顆粒內在化，主要包括直接胞吞作用、受體介導的胞吞作用及轉染劑介導的胞吞作用[5,6]。此外，還可以通過外加電磁場、在磁性納米顆粒表面修飾能與靶細胞膜上受體結合的配體等方法調控磁性納米顆粒標記干細胞。本文對間充質干細胞的組織修復原理、磁性納米顆粒參與協助間充質干細胞的組織修復以及現有的磁性納米顆粒標記干細胞的技術進行了系統綜述。

2 間充質干細胞用于組織修復

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是最早在骨髓中被發現的一種多能干細胞，隨后在骨骼、肌肉、脂肪、肝、肺、臍帶血、羊水中陸續被發現[1]。MSCs不僅具有干細胞獨特的自我更新的能力，還可以在不同的誘導條件下分化為不同的組織，如肌肉組織、骨組織、軟骨組織、神經組織、脂肪組織、內皮組織、上皮組織等[7]。而且，移植到體內后可以遷移到受損組織部位，抑制促炎性細胞因子的釋放，從而提高受損細胞的存活率[1]。一般MSCs的分離方法相對其他細胞而言較為簡單，并且分離后能夠在體外迅速擴增，這使得其在生物醫學領域的應用更加廣泛[8]。MSCs主要通過分化成目標組織、用于基因治療、通過旁分泌改善微環境等幾種方式進行組織修復。

(1)MSCs分化為目標組織治療疾病

通過系統性移植MSCs可以治療一些全身性疾病或局部組織、器官的病變，如血液系統疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤以及糖尿病胰島功能缺陷等[1,9]。體外培養大鼠骨髓MSCs并誘導其分化，發現骨髓MSCs分化的細胞呈典型的胰島樣細胞增殖。已經分化的細胞內胰島素mRNA蛋白呈陽性表達，而且分泌到細胞外的胰島素水平明顯高于分化前的細胞。將其注入糖尿病大鼠體內可以顯著調節血糖水平，這對利用干細胞治療糖尿病提供了新的思路[9-11]。

MSCs在進行系統移植時，還可以通過細胞因子誘導和局部環境定位到特定的組織和器官。在多項臨床前的動物實驗中，MSCs通過誘導分化為心肌細胞，重建心血管及肌肉功能，參與恢復心肌梗死后充血性心力衰竭。此外，將MSCs經靜脈注射或直接注射到梗死區域后，MSCs均可以定位聚集于損傷區，定向分化為心肌細胞，從而改善心功能[12-14]。

(2)MSCs用于基因治療

MSCs在基因治療中是一種極為理想的靶細胞，在移植前可以將多種外源性目的基因整合至MSCs基因組DNA，移植后能夠長期表達。MSCs不僅能穩定地轉染外源性的基因，而且表達的外源基因具有生物活性。研究表明，構建B區缺失的VIII因子cDNA逆轉錄病毒載體，以人的MSCs為靶細胞，在優化的轉導條件下可以使MSCs表達VIII因子[15,16]。

(3)MSCs通過自身旁分泌改善微環境

除了利用干細胞移植治療疾病外，一些疾病還能夠利用MSCs分泌的某些細胞活性因子進行治療。例如成體大腦損傷后很難治愈，原因在于成體大腦很少會出現神經和軸突的再生，受到損傷后中樞神經自發修復很有限，因此可以嘗試用干細胞分泌的細胞活性因子治療中樞神經損傷。Wimpenny等[17]發現移植的MSCs可以釋放活性軟骨形成蛋白BMP-4，該蛋白能夠促進神經祖細胞和干細胞內的星型膠質細胞的生長。

骨髓MSCs是目前常用于細胞移植治療的組織工程種子細胞，很多研究都致力于利用骨髓MSCs修復各種缺血梗死的機體組織[18-21]。骨髓MSCs可以通過旁分泌生成血管生成因子及分化為血管內皮細胞等途徑來促進血管再生，從而改善組織供血情況。Schumann等[22]將乳酸乙醇酸支架結合成骨樣細胞的生成血管能力與骨髓MSCs的進行對比，發現成骨樣細胞與骨髓MSCs分泌的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相當，血管密度基本一致。近年來有學者提出，骨髓MSCs的旁分泌機制是促進血管再生的主要機制，骨髓中的MSCs主要功能是支持造血、改善造血環境；造血干細胞和祖細胞與MSCs、細胞外基質以及血管組成的微環境的接觸可以促進骨髓中的紅細胞、血小板、巨噬細胞、粒細胞等細胞的分化和成熟[23]。造血祖細胞與MSCs的直接接觸是通過表面黏附的相關分子實現的，這種接觸能夠定位造血祖細胞。血管的形成過程需要許多生長因子的參與，通過MSCs分泌的多種細胞因子，如促血管內皮生長因子和促動脈生成長因子等，可以以旁分泌的方式調控造血細胞的分化與成熟，進而促進新血管的形成，圖1為新血管形成機制示意圖[24]。

圖1 新生血管形成機制示意圖[24]Fig.1 Schematic diagram of angiogenesis mechanism[24]

爆發性肝衰竭是一種死亡率極高的疾病，Shi等[25]利用骨髓MSCs的肝內移植成功治療了患有爆發性肝衰竭的大動物(豬)。利用多組學功能關聯分析技術，發現移植的干細胞主要是通過抑制炎癥介質分泌、調節免疫反應等旁分泌作用，來改變宿主對爆發性肝衰竭損傷的響應，最終促進宿主自身肝臟再生修復。

3 磁性納米顆粒在干細胞研究中的應用

納米尺度的磁性材料(即磁性納米材料)，因其具有良好的尺寸效應、表面效應、量子效應和獨特的磁性效應，引起了研究人員的極大興趣[26]。尤其是磁性氧化鐵納米顆粒，如Fe3O4納米材料(磁鐵礦)和γ-Fe2O3納米材料(磁赤鐵礦)，已被廣泛應用于生物醫學領域[27,28]。磁性納米材料并不只有人工合成的，很早之前人們就在大自然和一些生命體中發現了磁性納米材料，尤其是氧化鐵納米顆粒，人們在趨磁細菌[29]、魚類[30]、昆蟲[31]和鳥類[32]體內都發現了氧化鐵納米顆粒的存在。生命體可以利用自身的氧化鐵納米顆粒感知地球磁場，從而進行導航。氧化鐵納米顆粒具有生物可降解、溫和無毒的性質，并且可以通過調節粒徑調控磁性[2]，使其在生物醫學領域中展示出了巨大的應用價值。氧化鐵磁性納米顆粒由氧化鐵顆粒、生物相容性外衣、間隔臂及活性分子構成，其核心顆粒大小及表面修飾均會影響磁性氧化鐵納米顆粒的磁性及其他性能[33]。最初用于MRI和貧血治療的氧化鐵納米顆粒Ferumoxytol，是目前美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準的唯一可用于臨床的無機納米材料，因其具有良好的安全性，已被作為藥物廣泛用于炎癥和腫瘤成像的臨床實驗[34]。目前，藥用氧化鐵納米材料主要應用于核磁共振造影、體外生物分離、腫瘤磁流體熱療3大領域。氧化鐵磁性納米顆粒在干細胞研究中主要作為磁共振比對劑，應用于干細胞示蹤。

3.1 磁共振對比劑

水占了人體質量的2/3左右，人體中各個器官和組織中水含量不同，當器官或組織發生病變時，其水含量也會發生改變。MRI的原理就是利用生物體內水分子質子在外加磁場作用下產生不同的射頻信號，經計算機處理后轉化成圖像信息，其信號的強弱取決于生物體組織內含水量的多少。與計算機斷層掃描(computed tomography，CT)等成像技術相比，MRI無放射性，不會對人體組織細胞產生電離輻射，同時還可以通過不同的掃描序列和參數獲得大量反映體內正常組織和各種病變的信息，從而能夠準確地定位病變部位，判斷病變性質[35]。

對于病變的組織或器官，其含水量雖然與正常組織不同，但有時利用這種固有的組織特性產生的對比度不能精準地確定某些病變的性質，這就需要特殊制備的藥物，經腸胃給藥或靜脈注射的方式分布到生物體的病變組織，引起病變組織和正常組織的明顯不同，從而快速準確地診斷出病變部位。這種特殊制備的藥物就是MRI對比度增強劑，簡稱對比劑。對比劑本身并不產生信號，它是通過改變組織內的水含量，也就是氫核系統的弛豫時間，使病變組織與周圍組織形成明顯對比[36]。

目前臨床中廣泛使用的是順磁性金屬釓離子(Gd3+)的各種配合物和超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)作為MRI對比劑[37]。Gd3+對人體的毒性很高，在體內沉積后，影響Ca2+、Zn2+等離子的代謝，并對心臟和神經有很大的毒性[38]。雖然Gd3+可以與螯合分子形成穩定的配合物降低其毒性，但是臨床許可的安全用量仍然很低。最近一些研究表明，Gd3+對比劑的使用會造成肝腎功能不全的患者形成腎源性系統性纖維化，從而使得該類對比劑的安全性遭到質疑[39,40]。然而，相較于Gd3+，SPIONs的MRI成像靈敏度高、副作用較少、可降解、體內留存時間長且毒性低[3]。此外，鐵是人體所需的必須微量元素之一，成年人體內鐵含量高達3～4 g，氧化鐵納米顆粒進入人體后半個月之內可以被人體降解吸收，安全性遠高于釓配合物[41]。圖2為Gd3+對比劑與氧化鐵納米顆粒對比劑在神經膠質瘤假性進展方面的成像效果對比圖。圖2顯示氧化鐵納米顆粒對比劑沒有外泄，但Gd3+對比劑有明顯的泄露情況，如圖2中箭頭所示[42]。與Gd3+對比劑不同，對氧化鐵納米顆粒不需要進行泄露校正[40]。而且，氧化鐵納米顆粒作為對比劑時能夠區分腫瘤進展和假性進展，是良好的預后生物標志物。當有SPIONs存在時，會干擾固有磁場的均勻性，使其所在部位與周圍組織產生不同的磁場敏感性，造成周圍質子的快速移相，導致在T2和T1成像的弛豫時間減少[38]。SPIONs作為T2磁共振對比劑的主要作用是改變MRI的R2弛豫，縮短T2時間，減弱T2加權信號。其在納米范圍內穿透能力強，弛豫率為等濃度Gd3+的7～10倍，能在很低濃度下引起MRI成像，表現為信號減低區域，能與周圍組織形成對比。

但是，利用磁性氧化鐵納米顆粒標記干細胞進行MRI示蹤也存在一些問題，例如靈敏度相對不足，且標記的干細胞在體內死亡、裂解后釋放的氧化鐵納米顆粒能否造成非特異成像目前尚未定論；由于氧化鐵納米顆粒不能隨細胞的分裂而進行自體復制，所以在監測移植后干細胞的增殖和分化方面存在一定不足[4]。

圖2 Gd3+對比劑與氧化鐵納米顆粒對比劑成像效果對比圖[42]Fig.2 Comparison of imaging effects between Gd3+ contrast agent and iron oxide nanoparticle contrast agent[42]

3.2 體內細胞示蹤

細胞治療中的一個重要問題是細胞移植進入體內后如何對其進行區分和示蹤，以監視它們的遷移、增殖、活性、凋亡等情況。目前，在臨床應用和實驗室中多采用組織分析或病理活檢等有創檢查方法來評價細胞的遷移、分化、增殖以及存活數量等具體情況。這兩種方法都只能對所取出的部分進行檢查，并不能完全反映移植細胞的動態遷移及在體內的生存情況。要闡明治療效果的潛在機制，就必須全面評價移植到體內的MSCs的生存狀態及遷移情況。因此，細胞水平的MRI無疑為無創觀察體內細胞遷移和實施細胞追蹤提供了一種新的思路[43]。

MRI一般需要將移植細胞標記對比劑，以加強正常組織與移植細胞之間的明暗對比，但目前對細胞進行納米材料的標記尚無一套標準化流程。一般將待標記細胞與納米材料在體外進行共孵育，待納米材料進入細胞后，收集、清洗已標記的細胞，然后將標記細胞移植入動物或人體內，借助MRI技術觀察細胞的遷移和分布。細胞示蹤常用于免疫細胞示蹤和干細胞示蹤。由于順磁性金屬離子，如Gd3+、Mn2+標記細胞的靈敏度較低，需要大量的標記細胞，而納米顆粒化的金屬離子如SPIONs在磁共振掃描儀中可以產生很強的局部磁場，加速周圍水質子的弛豫速率從而產生很強的陰影對比效果，在超順磁性納米顆粒標記細胞存在的區域明顯變暗，因此常用磁性納米顆粒標記細胞進行細胞示蹤[44]。

超順磁性納米顆粒標記的細胞用于MRI示蹤已經被廣泛應用于多種類型的臨床前研究，例如自身免疫T細胞的器官特異性歸巢、毒性T細胞[45]和自然殺傷細胞[46]的腫瘤歸巢以及癌癥疫苗中DC細胞的遷移模式等研究[47]。當平均每個樹突狀細胞(dendritic cell,DC)細胞內的鐵含量為25 pg時，在磁場強度3 T下可檢測到100 cells/mm2[48]。例如，2009年的一項研究顯示，將標記了超順磁性納米顆粒的DC注射到骨髓移植的小鼠右后腿8 d后，利用MRI觀察到在小鼠頸部的淋巴結有明顯的信號減弱，顯示出DC發生了定向的遷移[49]。

細胞標記中很重要的一點是任何標記都不能在本質上改變細胞的性質，如干細胞不能改變其分化功能，免疫細胞不能改變其免疫學性質。細胞功能一旦發生改變，會引起治療效率的減弱甚至消失。而且，標記細胞的磁性納米顆粒不能對細胞活力、數量有明顯影響，不能引起明顯的細胞毒性。雖然磁性納米顆粒標記的干細胞能夠達到這些細胞安全性的要求[50]，然而也存在一些局限性，例如干細胞的分裂會稀釋細胞內磁性納米顆粒的濃度，從而影響長時間的觀察效果；細胞的死亡會導致磁性納米顆粒的分散等。因此如何在保證干細胞的細胞活性、增殖能力的前提下，提高磁性納米顆粒的標記效率是干細胞示蹤的首要問題[51]。

3.3 磁性納米顆粒對干細胞生命活動的影響

目前，磁性納米顆粒調節干細胞生命活動的研究還比較少，研究表明一些磁性納米顆粒在某些特定條件下可以促進干細胞的增殖分化，但其作用的效果及具體原因有待進一步研究，臨床應用也有待進一步開發[52]。

一些磁性納米顆粒標記干細胞后，可以通過促進干細胞的生長而增強其組織修復的功效，如促進骨髓MSCs的成骨分化和體內骨再生[53]。Huang等[54]報道了一種對人骨髓MSCs無毒性的磁性氧化鐵納米顆粒，能夠促進干細胞的生長。這種磁性納米顆粒可以通過提高細胞內過氧化物的活性從而減小細胞內的過氧化氫；此外，還通過調節細胞周期蛋白調節因子的表達，加速細胞周期，從而增強干細胞的生長[55]。

Wang等[55,56]利用基因芯片和生物信息學分析，更好地解釋了磁性納米顆粒促進骨髓MSCs成骨分化的分子機制。其結果表明，干細胞的基因表達受到磁性納米顆粒的調控，經典的MAPK信號通路被激活。因此，該通路下游的基因被調控，從而增強了成骨分化。在分子水平上，磁性納米顆粒上調了對于成骨分化至關重要的RNA INZEB2的表達，INZEB2的過表達抑制了ZEB2的表達，而ZEB2是抑制成骨轉錄的必需因子。圖3為磁性納米顆粒促進成骨分化示意圖。這些結果讓我們在分子水平上對磁性納米顆粒促進成骨分化的機制有了更加深入的理解，為促進磁性納米顆粒標記干細胞的臨床應用奠定了基礎[53-56]。

此外，將含有超順磁性納米顆粒的明膠海綿植入SD大鼠的門牙窩中，與對照組相比，骨再生明顯增強，成骨細胞和血管內皮細胞具有更好的成骨和血管生成性能[53,57]。

4 磁性納米顆粒標記干細胞的方式

納米顆粒標記干細胞的方式主要有兩種，一種是將納米顆粒依附于細胞表面，另一種是細胞將納米顆粒內在化，主要包括直接胞吞作用、受體介導的胞吞作用及轉染劑介導的胞吞作用[5,6]，圖4為納米顆粒進入細胞的不同途徑。體內實驗中，第一種方式有明顯的局限性，網狀內皮系統會識別并清除這些SPIONs標記的細胞。而通過內在化途徑，納米顆粒會留存在干細胞的細胞質中，并具有良好的生物相容性[58]。而對于某些非吞噬性細胞，內化納米顆粒的效率很低，可以通過在納米顆粒表面包裹病毒包膜或帶正電的高分子聚合物提高轉染效率。現階段可用于納米顆粒內化的轉染劑有多聚賴氨酸、硫酸魚精蛋白和脂質體轉染胺等[59-61]。

圖3 磁性納米顆粒促進成骨分化示意圖[55]Fig.3 Schematic illustration of iron oxide nanoparticles promoting osteogenic differentiation[55]

圖4 納米顆粒進入細胞的不同途徑[6]Fig.4 Different internalization pathways of nanoparticles[6]

目前，增強SPIONs跨膜的方法有：外加電磁場使磁性納米顆粒向照射部位靶向聚集[62,63]；在超順磁性納米顆粒表面修飾能與靶細胞膜上受體結合的配體，使得SPIONs與靶細胞特異性結合[64]；促進單核-吞噬細胞吞噬SPIONs，促進被動轉運；將納米顆粒與微氣泡共混合或將納米顆粒化學偶聯到微氣泡膜殼表面后超聲輻照，可以提高納米顆粒的標記效率。

Yang等[48]將細胞培養于磁控組裝基底上時，會減少磁性納米顆粒對細胞的標記。其原因在于組裝體可以促進前纖維蛋白基因過表達，而過表達的前纖維蛋白會抑制內吞及膜循環，造成細胞對磁性納米顆粒攝取減少。

細胞標記率與SPIONs濃度呈正相關，SPIONs濃度越高，細胞標記效率越高，但過高的濃度會導致細胞內鐵含量過多，影響細胞生物學活性及增殖能力。SPIONs標記細胞的有效安全濃度為20～50 mg/L，以適量濃度標記干細胞，不會對其生物學活性、增殖能力及多向分化能力產生明顯影響[57]。但無論用哪種方法進行干細胞標記，標記效率與細胞種類都有著密不可分的關系，在移植前需要對每種類型的細胞進行驗證。其次，在移植前必須對干細胞進行徹底的清洗以便去除過量的納米顆粒，避免殘留在細胞外的納米顆粒導致假陽性信號[58]。

5 結 語

干細胞治療是目前組織修復領域中最有潛力的治療方法，但由于缺乏有效的干細胞示蹤技術等原因，對干細胞移植后的分布、活性、分化方向、作用機制等認知較為缺乏，目前的多數研究都還停留在實驗階段。需要利用干細胞體內示蹤技術對移植到體內后干細胞的分布、活性、分化、凋亡情況進行檢測。MRI成像由于其無輻射、信號穿透衰減少、空間分辨率高、與組織對比度大等優點，是現階段比較合適的一種干細胞示蹤方式，且磁性納米顆粒作為MRI的對比劑，有著毒性小、生物相容性好、在體內維持循環時間長、成像質量高等優點。磁性納米顆粒除了作為對比劑外，還能夠誘導產生多能干細胞、促進干細胞的分化。但磁性納米顆粒依然存在其應用的一些局限性，例如干細胞移植體內后，其活性、分化、遷移等性質的改變可能會影響干細胞移植后在體內的治療、安全性等問題，因此目前多數研究僅處在體外實驗及動物研究階段。目前促進納米顆粒標記干細胞的方法中，將磁性納米顆粒進行表面修飾可以提高標記量，物理場的作用特點在于可以實現快速標記，結合兩者的優勢將是未來標記方式的發展趨勢。磁性納米材料作為一種新的細胞標記途徑具有廣闊的前景，相信隨著干細胞標記技術和分子影像技術的不斷發展，干細胞移植體內后的治療、安全性問題得到解決，磁性納米材料將在干細胞治療這一重要領域大展身手。