平原河網典型入河支流氨氧化菌分布特征

胡媛媛，蔡賢雷，梅琨，王斯妤，Randy A Dahlgren,3*

(1.溫州醫科大學 浙南水科學研究院，浙江 溫州 325035； 2.浙江省流域水環境與健康風險研究重點實驗室，浙江 溫州 325035；3.加州大學戴維斯分校 陸地、大氣與水資源系，美國 戴維斯 CA 95616)

平原河網地區河流縱橫交錯，人們往往沿河而居，居民的生產生活與水密切相關。伴隨著經濟的快速發展和城市化進程的加快，平原河網地區水體納污量不斷增加，尤其是含氮物質的大量流入，使河網水體的氮成為主要污染物之一，其污染與防治問題越來越受到廣泛關注。近些年來，水體中分布廣泛、代謝活躍的各類微生物成為研究的熱點[1]。研究表明，微生物在有機物的降解、生源要素的形態轉化和地球化學循環等方面發揮重要作用[2]，其中，自然界中氮的循環主要靠微生物驅動，比如氨氧化微生物可以驅動氨氧化反應將水體中的氨氮氧化為亞硝氮，該反應是硝化作用的第一步和限速步驟[3]，對河網水體中氮的消除和下游水體富營養化的控制具有重要作用。氨氧化反應中發揮關鍵作用的是amoA基因編碼的功能酶——氨單加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)，其中的α亞基可以將NH3氧化成NH2OH[4-5]。近幾年來，有大量關于具有amoA基因的氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的研究[6-10]。相關研究表明，AOB和AOA在不同環境中均有發現，且與不同環境因子呈現不同的相關關系，如pH值、營養鹽、溫度、鹽度等[11-12]。

水環境中的微生物，根據其生活方式的不同，可分為附著微生物和浮游微生物。而水體中的懸浮顆粒物作為水中微生物呼吸的熱點，其表面的附著微生物是有機質降解、營養素循環過程中重要而直接的參與者[13]。因此，在平原河網這種嚴重富營養化、大型水生生物消亡的水環境中，對顆粒附著和浮游微生物中的氨氧化微生物進行研究，可以使我們對平原河網的氮循環過程、生態系統結構和功能的變化有更好的了解[14]。

溫瑞塘河作為典型的南方平原河網，為溫州市人口、經濟和污染的聚集地，由于生活和工業污水的大量進入，導致其水環境問題日益突出[15-17]。舜岙河發源于山澗溪流，隨后流經村民生活聚集區，最后匯入河網，是溫瑞塘河一條典型的入河支流。在本研究中，我們以舜岙河為例，探究平原河網典型入河支流中AOB和AOA在顆粒附著與浮游微生物中的分布情況，并通過多元分析探究氨氧化微生物與環境因子的關系，這對深入了解平原河網氮循環過程、生態系統具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與樣品采集

采樣點位于浙江省溫州市溫瑞塘河茶山段的舜岙河(27°55′N，120°42′E)。該河源頭來自大羅山山澗溪流。上游水體為溪流形式，水淺、清澈，兩邊有村民種植的楊梅；沿上游往下為人為改造的幾個水潭，經常有村民在此進行洗衣、擦車等活動；向下進入舜岙村居民區，兩岸均為民房；最后下游匯入平原河網，水面隨河道逐漸寬闊。我們從上游到下游依次隨機選取12個點作為采樣點，分別標記為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11和S12(圖1)。其中，S1～S3分布于上游溪流形式的河道中，S4～S6分布于人為改造的水潭中，S7～S9分布于流經居民區的河道中，S10～S12分布于下游匯入平原河網的河道中。于2017年4月11日，用采水器采集表層水樣，用多參數水質測定儀YSI現場測定pH、水溫(T)、溶解氧(DO)、電導率(EC)等指標。水樣冷藏于保溫箱中1 h內運回實驗室進行后續分析。水體顆粒附著與浮游菌參照文獻[18-19]的膜過濾方法進行分離與獲取，經5 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾，截留在濾膜上的微生物為顆粒附著菌；經5 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾的水樣，再經0.2 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾截留的為浮游菌。收集的樣品-20 ℃保存，用于后續的DNA提取和定量PCR分析。同時，樣品過濾之前，取10 mL水樣，5 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾后再取10 mL過濾水樣，分別加入無顆粒甲醛(預先用0.2 μm濾膜過濾的分析純甲醛)進行固定，使甲醛的終濃度≥2%，樣品-4 ℃冷藏，分別用于后續總菌與浮游菌的計數，并通過總菌減去浮游菌獲得顆粒附著菌數目。

圖1 研究點位的分布

1.2 指標測定方法

1.2.1 水化學指標的測定

1.2.2 細菌計數

取無顆粒甲醛固定的樣品，加入DAPI溶液(終濃度為1 μg·mL-1)，染色10 min后，采用手持式過濾泵，在真空壓力小于10 mm Hg下，過濾至孔徑為0.2 μm的黑背景聚碳酸酯膜上，滴加無熒光鏡油，于熒光顯微鏡(DM 4000B, Leica)100倍油鏡下對總菌和浮游菌進行計數[21-22]。在紫外光的激發下，每個樣本隨機取20個視野計數。

1.2.3 DNA的提取與qPCR

采用FastDNA?Spin Kit for Soil對樣品進行DNA提取，提取方法參照該試劑盒所提供的說明書進行。參考Zeng等[23]的方法，分別以amoA-1F和amoA-2R[8]、Arch-amoAF和Arch-amoAR[10]為引物對氨氧化細菌amoA基因片段(491 bp)、氨氧化古菌的amoA基因片段(635 bp)進行擴增。分別以10倍梯度稀釋各重組質粒，得到各自的標準曲線，從而根據qPCR結果計算出相應的拷貝數。陰性對照、樣品和質粒均為3個重復，qPCR的體系為20 μL∶10 μL 2×TransStart?Top Green qPCR Super Mix，上下游引物各0.4 μL，0.4 μL Passive Reference Dye(50×)，8.4 μL ddH2O，0.4 μL DNA模板。

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0對數據進行方差分析(one way ANOVA)和Duncan多重對比。圖表由Excel和Origin 8.0軟件進行繪制。采用CANOCO 4.5軟件進行主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)。

2 結果與分析

2.1 水樣的基本理化性質

表1 不同位點的水環境狀況

2.2 細菌計數與amoA基因豐度

12個位點中浮游態細菌豐度與附著態細菌豐度存在顯著差異(P<0.05)，浮游態細菌的豐度多于附著態細菌(圖2)。從浮游態和附著態微生物群體中AOB和AOA功能基因拷貝數均值來看，浮游細菌中AOB和附著細菌中AOB的豐度無顯著差異，浮游AOB豐度略高于附著AOB豐度，AOB豐度總體來說高于AOA。而浮游AOA豐度顯著(P<0.05)高于顆粒附著態AOA。

圖2 不同微生物豐度對比

2.3 氨氧化微生物豐度與環境因子之間的關系

將所得到的環境因子做主成分分析(PCA)，結果見圖3。圖中樣點之間的遠近反映出不同點位水環境狀況的相異程度，點越近代表其環境因子的相似性越高，根據在PCA圖中的排序結果，大致可以得到4個分組，分別為S1～S3、S4～S6、S7～S9和S10～S12，分組情況與周邊環境的功能區大致吻合。而通過氨氧化微生物豐度進行RDA分析，可以發現12個樣點同樣可以得到4個分組，與PCA結果相似。另外，通過RDA分析，可知總氮、氨氮、TOC對氨氧化微生物的豐度有較強的作用。

圖3 環境因子分布PCA分析與氨氧化微生物分布的RDA分析

3 小結與討論

采樣研究結果表明，受不同功能區影響舜岙河各處的水質狀況差異顯著，從上游到下游水體有機污染逐漸加重。通過對水體微生物豐度進行測定，發現在非汛期，浮游態微生物豐度顯著高于顆粒附著態微生物豐度，浮游態氨氧化微生物豐度高于顆粒附著態氨氧化微生物豐度，其中氨氧化細菌豐度高于氨氧化古菌。經PCA和RDA分析發現，環境因子對氨氧化微生物豐度和分布存在影響，其中總氮、氨氮、TOC是影響氨氧化微生物豐度和分布的主要環境因子。

微生物在不同環境中如海洋[24-25]、大型富營養化淡水湖[26-28]等典型生態環境的研究有很多，有結果表明，微生物的數量會隨著水中營養程度的遞增而升高[29]，因此，水中微生物的數量分布與動力學轉換緊密體現著水體水質的狀況。黃瑾[30]在對太湖的研究發現，浮游態細菌豐度和多樣性的主要環境影響因子為氨氮、硝態氮和TSS等，在河口等營養程度較高的地區細菌豐度最高。本次研究的舜岙河是溫瑞塘河一條比較典型的入河支流，由于受到周圍不同環境的影響，其水質狀況呈現一定規律性的變化，水體有機物、氨氮含量呈現增高的趨勢，將環境因子進行PCA分析后形成了比較明顯的4個分區：其中位于平原河網入口處的S10～S12位點的總氮、氨氮和TOC等指標濃度最高，為該河中營養程度最高的區域，不難推斷其原因，即平原河網水體受到沿岸生活、餐廚污物的影響較大，又因其流速較慢、納污能力較強，使其成為嚴重富營養化、有機物較多的水環境，因此，一些指標普遍高于流速較快、水淺的上中游區域；其次為流經居民生活區的S7～S9位點；而位于上中游的S1～S3和S4～S6位點處的污染程度較低。通過對微生物的豐度進行測定，發現浮游態和附著態微生物群體的豐度存在顯著差異，浮游態微生物豐度普遍高于附著態微生物，雖然采樣河道水深較淺，但采樣時天氣晴朗，山澗來水較少，底泥未見懸浮，水質清澈，SS的測定結果也表明，水體懸浮顆粒物含量較低，尤其在舜岙河的上中游未匯入河網的河道中，因此，顆粒物含量較少可能是本研究中浮游態微生物豐度顯著高于附著態微生物的原因。

氨氧化微生物對平原河網水生態平衡、過量氮素的遷移轉化發揮著重要的作用。然而，作為氮循環的主要參與者，氨氧化微生物的豐度與分布亦受多種環境因子的影響[31]。研究結果顯示，舜岙河中氨氧化細菌受到周圍水環境的影響，進行RDA分析后可將12個樣品大致劃分為4個分組，而這個分組與基于環境因子的PCA分析結果相似，間接表明環境因子的變化對氨氧化微生物的分布具有重要意義。通過RDA分析可知，在本研究中對氨氧化微生物存在主要影響的環境因子為總氮、氨氮和TOC。另外，對比AOB和AOA，發現AOB的豐度顯著高于AOA，許多研究表明，AOB的豐度隨著氨氮濃度的升高而增加，在氨氮含量較高的生態環境中AOB的豐度高于AOA[32-33]。本次研究中氨氮濃度從上游到下游逐漸升高，在位于居民生活區和匯入平原河網的河口處氨氮濃度較高，可能為AOB提供了適宜的生存環境，而12個位點的pH變化幅度較小，呈弱堿性，也有利于AOB類微生物展現硝化活性，以上原因可能導致在舜岙河中AOB較AOA為優勢種群。將氨氧化微生物根據其生活類型分類后發現，無論是浮游態微生物中AOA還是AOB，其豐度均相應的高于附著態微生物中的AOA和AOB，可能原因為研究時該河中浮游態微生物豐度較顆粒附著態微生物高，導致浮游態氨氧化微生物也相應的多于附著態氨氧化微生物。