藏藥波棱瓜屬藥用植物DNA條形碼鑒定

黃思遠 孫寧陽 石晏丞

摘要：為評價DNA條形碼候選序列對藏藥波棱瓜屬植物的鑒定作用，探討波棱瓜屬植物鑒定新方法，本研究采用不同產地、不同海拔波棱瓜植物的ITS2、PsbA-trnH、rbcL、matK通用引物對110份樣品進行DNA提取、PCR 擴增和測序，比較4條DNA序列擴增效率和測序成功率;分析種內和種間變異;通過Barcoding gap 分析，構建NJ系統進化樹，評價各序列對西藏自治區、云南省、四川省不同海拔波棱瓜藥材的辨別能力。研究結果表明，ITS2序列在所研究的波棱瓜屬藥用植物中的擴增效率和測序成功率均為100%，其種內種間變異、Barcoding gap與其他DNA條形碼候選序列相比具有明顯的優勢，以ITS2序列作為DNA條形碼，可對波棱瓜進行準確、快速識別和鑒定，準確地弄清楚不同地區不同海拔所生長的波棱瓜之間的進化關系，為該藥用植物的質量控制、安全用藥及資源合理開發利用提供理論依據。

關鍵詞：波棱瓜屬;DNA條形碼;ITS2;matK;rbcL;PsbA-trnH

中圖分類號：S567.21+9.01?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0066-05

波棱瓜作為傳統的藏藥材，其用藥部位為其干燥種子。它的藥理作用在藏藥學著作《月王藥診》中被著述，波棱瓜子味苦、性寒，可和纖毛婆婆納、藏茵陳、止瀉木按一定劑量進行配伍煎湯，藏醫主要用其治療赤巴炎癥;此外波棱瓜子與玉石等配伍主要治療各種肝病[1]。波棱瓜子木脂素部位及其單體常用于治療黃疸、肝炎、消化不良及肝膽疾病。相關文獻報道，波棱瓜子的藥理作用主要有抗肝損傷[2]、抗肝炎[3]等。

DNA條形碼技術通過測定植物DNA序列進行比較來反映其遺傳差異，通過建立生物DNA 條形碼系統能夠實現快速、準確、自動化的物種鑒定[4-5]。目前，研究者們已經測定了10 多條植物候選DNA條形碼序列[6]，并在不同的類群中對各條形碼的鑒定能力進行了考察。ITS2序列中含有豐富的變異位點和信息位點，并且該序列在植物中廣泛存在，因此可以應用于物種的鑒定，對植物有較高的鑒別能力[7-8]?？梢酝ㄟ^ITS2序列來區分波棱瓜植物的產地，進行快速準確識別和鑒定，對研究波棱瓜的分布有指導作用，對其遺傳育種研究、種質資源的生乳研究以及資源保護和全利用都具有重要的理論和實踐價值。

本研究應用近年來提出的植物DNA 條形碼候選序列ITS2、 PsbA-trnH、rbcL、matK對波棱瓜屬植物進行研究，考察不同DNA 條形碼候選序列在波棱瓜屬藥用植物鑒定中的能力，以期建立波棱瓜屬藥用植物數字鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者所在課題組共收集110份波棱瓜屬樣本，具體樣本見表1。試驗樣本經西南民族大學藥學院顧健教授鑒定為波棱瓜屬[Herpetospermum pedunculosum （Ser.） C. B. Clarke]葉片和種子。其中葉片樣本100份，都為硅膠干燥的葉片，10份為成熟種子，采樣時間為2016年9月。測序公司為生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、PCR擴增及測序 取干燥藥材 30 mg，加入液氮充分碾磨，使用植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。matK、rbcL、PsbA-trnH、ITS2的擴增引物見表2;候選DNA條形碼序列的PCR擴增體系見表3。

1.2.2 數據處理 試驗主要應用的軟件有DANMAN、MEGA version 5.1和SPSS 16.0。運用DANMAN軟件查看測序成功的序列，并將序列錄入到MEGA version 5.1軟件中，進行序列之間遺傳距離的分析進而構建系統進化樹，分析保存序列的變異位點、序列的遺傳距離;運用SPSS 16.0進行Wilcoxon秩和檢驗分析，比較各個序列的變異程度;通過Barcoding gap，查看序列的種內、種間差異情況，觀察是否出現顯著gap，進一步挑選合適的DNA條形碼片段;運用MEGA version 5.1軟件中的鄰接法（NJ），分析不同序列物種識別和鑒定能力。根據系統進化樹計算K2P距離，設100次重復檢驗。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

陰性對照（CK）采用加入和模板等量ddH2O后擴增的PCR產物，從圖1可以看出，CK組無條帶，說明樣品PCR擴增成功，不存在真菌污染，4條序列樣本電泳條帶均明亮，滿足試驗要求。

2.2 PCR擴增率和測序成功率

對樣本的ITS2、matK、PsbA-trnH、rbcL等4條候選序列進行PCR擴增效率（出現明顯條帶）和測序成功率（測序獲

得高質量序列）統計，結果（圖2）顯示，ITS2、matK序列為100.0%，PsbA-trnH序列擴增效率為91.0%，rbcL序列擴增效率為85.0%;ITS2測序成功率為100.0%，matK測序成功率為88.9%，PsbA-trnH、rbcL測序成功率都為97.8%。

2.3 候選DNA條形碼序列特征

本研究對不同產地不同海拔波棱瓜樣品的4個DNA片段ITS2、matK、PsbA-trnH、rbcL進行測序。測序所得的序列用DANMAN軟件進行排列剪切，然后用MEGA 5.1軟件統計序列的變異位點、保守位點、序列長度、GC含量等基本信息。從表4可以看出，在4個基因片段中，ITS2有54個變異位點，并且變異程度最高，為22.7%;rbcL變異程度最小，為0.4%;變異程度表現為ITS2>PsbA-trnH>matK>rbcL。因此選擇基于ITS2基因對波棱瓜不同產地及海拔樣品進行比對。序列matK的擴增片段最長，而ITS2最短。

2.4 種內種間的變異分析

從表5可以看出，4種序列種間變異平均值由大到小的順序為ITS2>PsbA-trnH>rbcL>matK;種間最小變異的順序為ITS2>PsbA-trnH>matK>rbcL;種內變異平均值順序為ITS2>PsbA-trnH>rbcL>matK。通過對波棱瓜屬各條形碼候選序列的種間變異、種內變異、種間最小變異分析發現，ITS2序列滿足種間變異應當大于種內變異，并且種間最小變異應當小于種內變異這一條件。

2.5 候選DNA條形碼Wilcoxon秩和檢驗

候選DNA條形碼兩兩序列相關程度，一般通過Wilcoxon秩和來檢驗。此方法可以更加準確地反映出兩兩序列樣本的差異程度。從表6可以看出，ITS2序列與其他3條序列具有顯著差異。通過檢驗發現，ITS2序列種間的變異情況較其他序列快。

2.6 DNA條形碼Barcoding gap檢驗

理想的條形碼種間遺傳變異應明顯大于種內遺傳變異，并在二者之間存在顯著差異，形成一個明顯的間隔區，即Barcoding gap。從圖3可以看出，rbcL序列的種內遺傳變異值和種間遺傳變異值主要集中在0～0.001區域，matK序列的種內遺傳變異值和種間遺傳變異值集中在0.002～0.003區域，重疊部分多，無明顯gap;PsbA-trnH的種內遺傳變異值小，均集中在0～0.001區域，種間遺傳變異值在0～0.001、0.002～0.003區域均有分布，種內種間遺傳變異重疊部分少，gap不明顯。ITS2種內遺傳變異值在0～0.004區域均有分布，種間遺傳變異值分布范圍廣。ITS2的種內種間遺傳變異所行成的bar coding gap明顯，但重區域較小，有利于區分物種。

2.7 ITS2、PsbA-trnH、rbcL、matK序列NJ系統進化樹鑒定結果

根據各序列對所有樣本構建NJ系統進行樹（圖4、圖5、圖6、圖7）。從NJ進化樹可以看出，PsbA-trnH序列構建的系統進化樹中的樣本有明顯的種內差異，沒有明顯的種間變異，不能鑒別出不同海拔樣品。matK序列和rbcL序列構建的進化樹可將不同產地不同海拔的樣本聚類成一大類，種間距離很小，無法區分，鑒別效果不理想。ITS2序列構建的進化樹可以很好地區別出云南波棱瓜，同時四川省和西藏自治區樣品聚類為一類，與參照序列聚類距離遠，有明顯的種間距離。

3 討論

波棱瓜為來源于葫蘆科波棱瓜屬的植物，以種子入藥，是臨床常用藏藥。波棱瓜屬植物主要分布于青藏高原地區，在我國主要分布在西藏自治區、四川省、云南省，在國外印度、尼泊爾也有分布。波棱瓜普遍生長在路邊、林緣及山坡低矮灌木叢中，海拔為 2 300～3 500 m[9-10]。波棱瓜藥用歷史悠久，但存在稱謂混亂導致用藥混亂的現象，因此對波棱瓜屬植物進行準確識別和鑒定，對該藥材的安全使用和波棱瓜資源的合理開發及保護都十分重要。

本研究通過對不同產地不同海拔采集的波棱瓜植物樣本進行PCR擴增、測序可知，ITS2序列長度約為238 bp，擴增成功率和測序成功率都為100%，有54個變異位點，變異率為22.7%，DNA條形碼變異率較高，種間種內差異明顯，種間最小變異小于平均溯祖度。Wilcoxon秩和檢驗的結果是ITS2變異檢驗值大于其他3個序列。從Barcoding gap圖中能夠看出，ITS2種間遺傳變異分布范圍廣，與種內遺傳變異值的重疊區域較小，有利于區分物種。

PsbA-trnH間隔區在被子植物中具有高度變異性，其兩端具有75 bp的保守區序列，便于設計通用引物[6，11]，在波棱瓜屬中的擴增效率為91%，從Barcoding gap圖中可以看出，PsbA-trnH序列的種內和種間遺傳變異值的集中區域雖然沒有重疊，但gap不明顯，所以PsbA-trnH序列不適合單獨作為波棱瓜屬植物的DNA條形碼。matK序列是植物葉綠體DNA 中進化較快的一條編碼區序列，也是多位研究者推薦的條形碼序列之一[6，12-15]。本試驗中，matK序列在波棱瓜屬植物中擴增效率雖然高，但是測序成功率僅為88.9%，低于其他3條序列，且種內種間重疊部分多，無明顯gap，因此matK不適合作為條形碼對波棱瓜屬植物進行鑒定。rbcL序列的種間和種內遺傳變異值分布區域接近且無明顯gap，因而判定rbcL也不適合作為波棱瓜屬植物的DNA條形碼序列。從NJ系統進化樹圖中能夠看出，除ITS2序列構建的系統進化樹以外，其他3條均不適合獨自作為波棱瓜屬的條形碼來區分不同產地的波棱瓜。

參考文獻：

[1]馬哈也那，馬世林，王振華，等. 月王藥診[M]. 蘭州：甘肅民族出版社，1993.

[2]顧 健，李佳川，樊利娜.藏藥波棱瓜子總木脂素對刀豆球蛋白（ConA）致免疫性肝損傷小鼠保護作用及其機制探討[J]. 西南民族大學學報（自然科學版），2014，40（3）：375-387，481.

[3]叢龍波，王 琪，李仙義，等. 藏藥波棱瓜子抗肝炎藥效物質基礎研究[J]. 醫學研究雜志，2007，3（8）：75-76.

[4]Bhargava M，Sharma A. DNA barcoding in plants：evolution and applications of in silico approaches and resources[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2013，67（3）：631-641.

[5]任瑤瑤，江南屏，劉睿穎，等. 應用ITS2序列鑒定四川車前、平車前、大車前[J]. 江蘇中醫藥，2017，49（5）：57-60.

[6]朱英杰，陳士林，姚 輝，等. 重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究[J]. 藥學學報，2010，45（3）：376-382.

[7]Yao H，Song J，Liu C，et al. Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals[J]. PLoS One，2010，5（10）：e13102.

[8]豆榮昆，畢振飛，白瑞雪，等. 黃花紫堇、多刺綠絨蒿及其同屬近緣物種的ITS2條形碼鑒定與分析[J]. 中國中藥雜志，2015，40（8）：1453-1458.

[9]盧 杰，蘭小中，羅 建.林芝地區珍稀瀕危藏藥植物資源調查與評價[J]. 資源科學，2011，33（12）：2362-2369.

[10]關法春，王 超，權 紅，等. 西藏野生波棱瓜資源的調查和分類[J]. 西南農業學報，2011，24（2）：832-834.

[11]Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，et al. Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（23）：8369-8374.

[12]魏星任，葉清蓮，馬新業，等. 涼粉草DNA條形碼通用序列的篩選及其混偽品分子鑒定[J]. 江蘇農業科學，2017，45（13）：32-35.

[13]劉政澤，劉 博. 基于ITS+matK序列探討部分藤黃屬植物的種間親緣關系[J]. 江蘇農業科學，2017，45（13）：39-42.

[14]Chase M W，Cowan R S，Hollingsworth P M，et al. A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants[J]. Taxon，2007，56（2）：295-299.

[15]Lahaye R，Van Der Bank M，Bogarin D，et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（8）：2923-2928.