丙炔苯丙胺對帕金森病模型大鼠結腸自噬相關蛋白Beclin1及LC3表達的影響

畢樹立，成小華，劉昊，劉斌

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種常見的中老年人神經系統變性疾病,主要病變位置在黑質和紋狀體,其錐體外系主要表現為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態異常，常伴有便秘等結腸功能障礙[1-2]。PD發生結腸功能障礙的具體機制尚不清楚,有文獻報道可能與腸道自噬功能紊亂有關[3]，對于人類而言，自噬引發的腸道疾病和功能失調可能更加危險，因此，自噬參與PD腸道功能失調的研究逐漸引起臨床工作者的重視。細胞自噬的形成與多種自噬因子有關，其中自噬相關蛋白Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3, 簡稱LC3)為重要的細胞自噬因子[4]。丙炔苯丙胺(司來吉蘭)是一種常見的單胺氧化酶B拮抗劑，它能夠拮抗各種神經毒素對黑質細胞的毒害而起到神經保護作用[5]，進而阻止PD進展，同時對胃功能障礙具有很好的保護作用[6]，但其對PD大鼠模型的結腸功能障礙影響如何尚不明確，本研究通過觀察司來吉蘭對PD模型大鼠結腸自噬相關蛋白Beclin1、LC3表達的影響，探討司來吉蘭治療結腸功能障礙的可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只,4～5個月，體質量250～300 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司；均飼養于屏障環境動物實驗室，室溫控制在21～25℃左右，自然光照，先適應喂養2周，再進行試驗。(2)藥物與試劑：司來吉蘭(Orion Corporation Espoo，Finland)，片劑，規格5 mg/片；魚藤酮粉末，購自北京博奧森生物工程有限公司；葵花油，購自唐山華盛超市；Anti-LC3與Rabbit Anti-Beclin 1購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB顯色液購自北京中杉生物有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白購自華美生物公司；(3)儀器：奧林巴斯BX63全自動顯微鏡掃描系統購自日本奧林巴斯公司；高速臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法 2013年1月—2017年10月唐山市開平醫院與華北理工大學附屬醫院合作實驗。大鼠72只按隨機數字表法分為假手術組、模型組與干預組，并根據預實驗結果，各組大鼠再隨機于模型制備成功后4 d和8 d分別取12只進行檢測，其中6只以免疫組織化學法檢測，6只以Western blot法檢測。

1.2.1 PD大鼠模型制備[7]： 因魚藤酮是脂溶性藥物，故應用葵花油將魚藤酮充分溶解，配制成濃度為2 mg/ml魚藤酮葵花油溶液，然后充分震蕩、混勻，避光保存。模型組與干預組大鼠稱質量后，以魚藤酮2 mg/kg給藥。經碘伏消毒后，捏起大鼠的頸背部皮膚，在皮下注射脂溶性藥物。參照呂超男等[5]的帕金森病大鼠模型行為學評分標準，進行行為學的檢測，大鼠的行為變化被分為6個等級記分：1分，大鼠表現為拒捕的行為減弱，豎毛、毛色變黃、變臟，弓背、主動活動減少；2分，除了有1分表現外，大鼠的自主活動明顯減少、動作遲緩，同時具有震顫或步態不穩；4分，具有2分的表現且步態不穩，或不能直線行走，或步行時間向一側旋轉；6分，可向單向斜臥，單側前肢和/或后肢的癱瘓，行走困難或進食困難；8分，單側前肢和/或后肢的完全癱瘓，四肢攣縮，體質量明顯減輕，均不能進食；10分，瀕臨死亡或死亡。在行為學上，2～6分之間的大鼠神經細胞缺失相對顯著，并且帕金森病動物模型可靠，可作為判定PD模型成功的標志[8]。

1.2.2 干預方法： 當模型制備成功后，每日給假手術組與模型組大鼠灌胃同等量生理鹽水，干預組每日灌胃丙炔苯丙胺0.5 mg/kg，每個亞組大鼠分別連續灌藥4 d或8 d。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 Beclin1、LC3陽性細胞表達檢測：采用免疫組化法檢測,按照試劑說明書操作步驟進行。每組隨機取6只大鼠，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，行多聚甲醛灌流(濃度4%)后固定，大鼠剖腹后，取結腸1.5～2.0 cm，清除凈腸內容物，剪掉腸管多余物質，予4%多聚甲醛溶液分別固定24 h。常規方法包埋、切片、脫蠟、水化和抗原修復；將內源性過氧化物酶用0.3%過氧化氫封閉20 min；1%山羊血清再次封閉 20 min，分別加入一抗(Anti-LC3、Rabbit Anti-Beclin 1)，4℃孵育18 h；加生物素二抗，37℃環境中孵育 25 min；再加辣根酶標記的鏈酶卵白素，37℃環境中孵育 25 min。以上各步驟分別用PBS 緩沖液浸洗 3 min×3 次。最后行 DAB 顯色,光鏡下仔細觀察。以胞質或胞核呈淡黃色或棕褐色為陽性細胞，在100倍光鏡下，隨機觀察每組大鼠結腸互不重疊的6個視野，進行LC3、Beclin 1陽性細胞計數。

1.3.2 Beclin1、LC3蛋白表達檢測： 采用Western blot蛋白印記法檢測，取潔凈結腸1.5～2.0 cm，立刻投入液氮，在-80℃EP管中保存。將上述冷凍結腸取出，以濃度為40 mg/kg放入蛋白裂解液，電動勻漿，在冰浴環境中靜置30 min，離心取上清液，-20℃保存備用。SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗、二抗孵育，以ECL顯色，膠片曝光顯影，結果用Image J圖像程序分析軟件分析目的蛋白條帶及內參的吸光度值,二者的比值即為相對表達量。

1.3.3 1 h糞便排出量及含水量測定： 參考學者前期研究報道的實驗方法[9]，在造模成功后4 d與8 d，各組各取6只大鼠，將每只大鼠單獨放于底部鋪有濾紙的籠子內，當大鼠排出糞便后，立即收集于1個密閉管中,稱質量后即為糞便排出量(濕質量); 在65℃脫水爐中保存12 h，分別稱質量即為糞便干質量。糞便含水率(%)=(糞便濕質量-糞便干質量) /糞便濕質量×100%。

2 結 果

2.1 3組大鼠免疫組化檢測Beclin1、LC3陽性細胞比較 假手術組大鼠各時間點結腸可見少量Beclin1、LC3陽性細胞的表達。與假手術組比較，模型組各時間點結腸Beclin1、LC3陽性細胞數均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，干預組大鼠各時間點結腸Beclin1、LC3陽性細胞數均顯著減少(P<0.01)；與4 d時比較，干預組8 d時Beclin1、LC3陽性細胞數顯著減少(P<0.01)，而假手術組及模型組不同時點比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 3組大鼠Western blot檢測Beclin1、LC3蛋白比較 蛋白質印跡檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組各時間點結腸可見Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達量較多(P均<0.01)。與模型組比較，干預組各時間點結腸Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達均減少(P<0.01)。與4 d時比較，干預組8 d時大鼠結腸Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達量降低(P<0.01),而假手術組及模型組不同時點比較差異均無統計學意義(P>0.05)見表2，圖2、3 。

2.3 3組大鼠1 h糞便排出量及含水率比較 注射魚藤酮35 d左右，大鼠發生了PD行為學改變，其中5只大鼠不能進食水，給予淘汰，另有3只大鼠死亡，均給予補充。1 h糞便排出量及含水率模型組大鼠均低于假手術組(P<0.01)，干預組均高于模型組(P<0.01)；且干預組8 d時高于干預4 d時(P<0.01)，而假手術組及模型組各時點比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表1 3組大鼠結腸Beclin1、LC3陽性細胞數比較個/HP)

表2 3組大鼠結腸Beclin1和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白比較

注：Beclin1相對分子質量為50 000

圖23組大鼠結腸Beclin1蛋白比較

注：LC3Ⅱ、LC3Ⅰ相對分子質量為16 000、18 000

3 討 論

目前PD的腸功能紊亂日益受到臨床關注，同時便秘是PD患者腸功能紊亂的最常見主訴[10-11]。有研究結果表明經魚藤酮葵花油乳液制作的大鼠模型發生了便秘[12]，另一項研究結果證實PD大鼠模型早期發生了便秘[13]，本研究結果中PD模型組大鼠4 d、8 d時的1 h糞便排出量及含水量明顯低于假手術組，證明模型組大鼠的腸管蠕動速度明顯減慢，PD可能導致腸管功能障礙，這與Fasano等[14]的研究結果一致。

帕金森病患者早期發生便秘的機制尚不明確,可能是多因素交互作用的結果,如結腸多巴胺脫羧酶關鍵限速酶酪氨酸羥化酶(TH)的減少及α-突觸核蛋白(α-Syn)的增多[12]，另一項研究提示單光子發射計算機掃描的多巴胺轉運蛋白(DAT)與便秘無關[2]，提示帕金森病患者便秘可能是非多巴胺通路的損害，如氧化應激、細胞凋亡、興奮性毒性或自噬[3]，自噬可以理解為自食，其結局可導致細胞內一部分受損或多余的老化蛋白和細胞器被吞噬和降解甚至消化，便于細胞生存，同時使機體應對各種應激狀態，但當刺激過度或時間較長時，細胞會發生自噬性細胞凋亡，這種表現即可出現于帕金森大鼠模型黑質紋狀體內，又可在饑餓大鼠模型心肌中表現[15]。Beclin-1既是調控自噬的關鍵因子[16]，也是檢測自噬活性的重要標志物。Beclin-1主要與Vps34蛋白結合形成Ⅲ型磷脂酰肌醇-3磷酸激酶復合體參與自噬泡的形成[17]。LC3是哺乳動物發生自噬的關鍵蛋白，其表達形式為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3Ⅰ經過泛素化加工修飾，可與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3Ⅱ并融合于自噬體膜上，參與自噬體的形成，另有研究發現自噬體數量的多少與LC3Ⅱ含量的高低呈正相關，同時Western blot法檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也是檢測自噬活性最直接的方法。眭怡群等[18]發現在大腸癌組織中Beclin-1、LC3的自噬活性明顯上調，提示自噬活性的提高在大腸癌發病過程中可能起著一定作用，吳淑華等[19]發現在大腸癌組織中Beclin-1、LC3蛋白表達量均明顯高于癌旁組織，提示過度自噬參與了結腸癌的發病進程。Tusco等[3]發現PD患者發生便秘與腸道發生自噬功能紊亂有關。關永俊等[20]發現大鼠結腸Cajal間質細胞自噬蛋白Beclin-1、LC3表達明顯上調，表明Cajal間質細胞發生了過度自噬性凋亡，這可能是大鼠慢傳輸型便秘的發病機制。本研究發現，PD大鼠模型組Beclin-1、LC3陽性細胞表達數量明顯增加，Beclin-1蛋白量、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值顯著升高。結果表明，大鼠經魚藤酮給藥后,結腸細胞發生了自噬,在自噬早期,大鼠機體尚能夠有效清除結腸神經變性產生的毒性物質,并可能對結腸蠕動有加強作用,但隨著疾病的進展,尤其是大鼠達到了帕金森大鼠模型的評分標準后,大鼠機體不能夠有效清除大量自噬細胞Beclin-1、LC3產生的毒性物質,導致PD大鼠模型結腸功能紊亂，進而發生了腸功能障礙,最終發生了便秘，進而提示PD模型大鼠結腸過度自噬可能參與了PD大鼠便秘的發生、發展過程。

表3 3組大鼠1 h糞便排出量及含水率的比較

丙炔苯丙胺對多巴胺的分解具有專一抑制性，能夠有效穩定腦內的多巴胺水平[21]，同時也能夠抑制突觸前膜對多巴胺的重新攝取，促進多巴胺的有效釋放，并能夠延緩左旋多巴的應用時間，進而延緩PD患者臨床癥狀的發生。本研究顯示，PD模型大鼠經司來吉蘭治療后，大鼠1 h糞便排出量及含水率顯著增加，同時，丙炔苯丙胺干預各亞組Beclin-1、LC3陽性細胞的表達及蛋白的含量均明顯減少，說明丙炔苯丙胺可能對結腸過度自噬性細胞Beclin-1、LC3產生的過多的蛋白質或衰老的細胞器具有有效清除作用，并有時間積累效應，使大鼠結腸細胞自噬基礎水平趨于穩態，隨著大鼠結腸蠕動速度增快，PD大鼠的腸功能障礙得到改善，其作用機制可能與其抑制PD模型大鼠結腸自噬性細胞Beclin-1、LC3的過度自噬有關，且隨著治療時間的延長，效果更明顯。這可能為PD患者便秘的防治提供了一定的理論依據。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

畢樹立:設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；成小華：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；劉昊、劉斌：提出研究思路，分析試驗數據