蓮草直胸跳甲OBP51的克隆及表達分析

胡 軍 ，付 麗 ，王亞茹 ，張 彬 ，劉艷紅 ，賈 棟 ，馬瑞燕

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801；3.山西農業大學園藝學院，山西太谷030801）

蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是全球入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵，其已在世界范圍內用于防治該惡性雜草[1-2]。目前，生物防治是最有效的防治手段[3]。昆蟲通過觸角辨別不同的氣味實現定位寄主植物[4]，氣味分子通過自由擴散進入昆蟲觸角淋巴液后，首先由氣味結合蛋白（OBP）將其運輸并穿過淋巴液，送達神經突觸上的氣味受體（OR），OR在收到氣味分子后，產生神經沖動，實現化學信號與電信號的轉換，并最終引起昆蟲吸引、取食、逃避等行為反應[5-6]。因此，OBP能否攜帶特定的氣味物質到達OR是昆蟲能否識別氣味分子的關鍵。

目前，已有多種昆蟲OBP參與識別植物揮發物被報道。其中，草地螟（Loxostege sticticalis）OBP2對植物揮發性物質中含量最高的反式-2-依維派鈉、順式-3-己烯基乙酸鹽有高的親和力和強的電生理反應[7]；白背稻虱（Sogatella furcifera）OBP2、OBP11對水稻揮發物2-十三烷酮、β-紫羅蘭酮有高親和力[8]；苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）OBP10 對6種植物宿主揮發物月桂烯、β-蒎烯、β-紫羅蘭酮、3- 己酮、（E）-2- 己烯醛、1- 己醇有高的親和力[9]；中華蜜蜂（Apis cerana）OBP2、CSP3對花揮發物 β-紫羅蘭酮均有高親和力[10]；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）OBP17、OBP18對多種植物揮發物尤其是β-紫羅蘭酮有高的親和力[11]；綠盲蝽（Apolygus lucorum）的 3 種 OBP（OBP3、OBP4、OBP6）和一種化學感受蛋白CSP1對植物揮發物沒有親和力，但對大部分次生代謝產物均有較高的親和力[12]；樟巢螟（Orthaga achatina）OBP2對植物揮發物法尼醇和法呢烯有高的親和力[13]；華北大黑鰓金龜的2種OBP（OBP1、OBP2）均對植物揮發物有高的親和力[14]。

本試驗克隆蓮草直胸跳甲OBP51全長cDNA序列，分析其序列特征，并利用定量PCR分析其在成蟲不同組織中的相對表達量，旨在了解OBP51在蓮草直胸跳甲氣味識別過程中的作用，為進一步揭示蓮草直胸跳甲專一取食喜旱蓮子草的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

蓮草直胸跳甲蟲源來自山西農業大學生物安全與生物防治實驗室長期飼養種群，在人工氣候箱中飼養完成，飼養溫度為25～27℃，光照條件為光照∶黑暗＝14 h∶10 h，濕度為85%。取食的喜旱蓮子草為山西農業大學生物安全與生物防治實驗室溫室中常年種植。

PhusionRHigh-Fidelity DNA Polymerase購自NEB（伊普斯威奇，英國）；M-MLV反轉錄酶購自Promega（麥迪遜，美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.2 OBP51全長基因克隆

表1 研究所用引物

取30頭化蛹3 d的蓮草直胸跳甲成蟲觸角，液氮研磨后用 TRIzol提取總 RNA；取 1 μg總RNA，用M-MLV反轉錄酶反轉錄成cDNA后用PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase進行全長序列擴增，PCR反應體系為cDNA模板1 μL，5×反應緩沖液 4 μL，引物 OBP51-F/R（表 1）各 1 μL，dNTP 0.5 μL，DNA 聚合酶 0.2 μL，去離子水 12.3 μL。擴增程序為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃20 s，35個循環；72℃5 min。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行切膠回收，連接到pEASY克隆載體后送至生工公司進行測序。測序無誤的單克隆加甘油后保存于-80℃備用。

1.3 OBP51序列分析

使用NCBI的ORF Finder進行ORF預測，使用SignalP 5.0分析信號肽，使用COBALT進行多序列比對，使用Compute pI/Mw計算等電點與分子量，使用ExPASy ProtParm進行蛋白質理化特性分析，使用PSIPRED預測蛋白質二級結構[15]；采用Mega 7.0的NJ法構建系統進化樹，其中，boot strap為1 000次。

1.4 OBP51組織表達分析

取化蛹后3 d的蓮草直胸跳甲成蟲觸角、頭、胸、腹、后足、翅，分別提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser去基因組并反轉后保存于-20℃備用。使用ABI7500進行定量PCR，體系（20 μL）為：2×TBGreenTMPremixExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）10 μL，引物 OBP51-qF/qR（表 1）各1 μL，模板1μL。反應條件為95℃3min；95℃30s，58℃30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；72 ℃ 5 min。60～95℃進行融解曲線分析。采用雙ΔCt法計算OBP51的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 OBP51基因克隆及分析

經PCR擴增，電泳檢測，得到約400 bp的特異條帶，隨后克隆和測序，獲得OBP51的cDNA全長為 489 bp（圖 1），其中，5′UTR 34 bp，ORF 411 bp，3′UTR 44 bp，編碼 136 個氨基酸；經 Blast比對，其與多種其他昆蟲OBP均具有高的相似性，其中，與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a最高，為40.52%。初步確定該基因為氣味結合蛋白，并命名為AhygOBP51。

2.2 OBP51序列分析

信號肽分析表明，AhygOBP51含有18個氨基酸殘基的信號肽，成熟蛋白為118個氨基酸，分子量為13.06ku，等電點為4.83，為酸性蛋白。含有4個保守的半胱氨酸殘基，缺少Classic OBP特征模式C1X24-29C2X3C3X22-43C4X8-10C5X8C6中的C2和 C5，為 Minus-C 型 OBP。賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）含量均高于 10%，分別為11.9%，11.9%，11.0%和10.2%。不含精氨酸、色氨酸和酪氨酸。總平均疏水性-0.477，不穩定系數40.52，脂肪族氨基酸指數74.41，表明AhygOBP51為脂溶性疏水蛋白，與氣味結合蛋白在觸角淋巴液的疏水環境是相符的。二級結構預測顯示，主要為α- 螺旋（helix），占 68.6%；其次為無規則卷曲，占28.8%。其符合氣味結合蛋白的結構特點。

2.3 OBP51多序列比對和進化分析

將AhygOBP51與其他物種OBPs進行多序列比對，結果發現（圖2），除了含有4個保守的半胱氨酸殘基外，在C1與C3之間含有保守的苯丙氨酸（F），C4之后有更加保守的組氨酸（H），推測這些保守的氨基酸殘基可能與其定位或者運輸氣味分子的功能密切相關。

系統進化分析顯示（圖3），雖同為Minus-C型OBP，但被分為4個大分支，AhygOBP51與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a的進化距離最近，與食糞金龜（Onthophagus taurus）OBP56d、大蠟螟（Galleria mellonella）OBP56d、葡萄花翅小卷蛾（Lobesia botrana）OBP44等位于同一大分支上。

2.4 OBP51表達分析

采用定量PCR對OBP51在成蟲不同組織的表達模式進行分析，結果顯示（圖4），在觸角中高表達，在后足中也高表達，且雄蟲后足的表達量高于雌蟲后足。OBP51在不同組織中的表達量大小為觸角≈后足＞頭＞翅＞胸＞腹。在觸角和后足中的高表達提示，其除了參與觸角對氣味分子的識別外，可能還參與后足的其他功能。

3 結論與討論

蓮草直胸跳甲作為入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵，在該惡性雜草的生物防治過程中占有重要的地位。本研究克隆得到蓮草直胸跳甲的AhygOBP51，具有4個保守的半胱氨酸殘基，模式符合Minus-COBPs家族的典型特征。Blast分析顯示，編碼蛋白與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a相似性最高，為40.52%；系統進化分析也表明，AhygOBP51與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a等聚為一支，表明其親緣關系較近，可能具有相似的功能。

OBP基因最早被發現特異性表達于家蠶觸角中[16]。后來更多的研究發現，OBPs主要在化學感受器官中表達[17]，在翅、足中也表達。除了觸角，其他組織中也分布有大量的味覺、嗅覺感器，推測可能參與昆蟲對寄主的定位[18-20]。組織表達分析顯示，AhygOBP51在后足、觸角中高表達，這可能與昆蟲能高效感受環境中各種氣味有關。除了觸角，OBP在足中高表達也在其他昆蟲中被發現，如茶尺蠖中多個OBP在足中高表達[21]；同樣的結果也在大草蛉[22]、松褐天牛[23]、茄無網蚜[24]中被發現，推測可能與感知寄主植物非揮發性物質有關[25-28]，此推測有待進一步證實。

本試驗成功克隆了蓮草直胸跳甲OBP51基因，并進行了相關生物信息學分析；熒光定量PCR分析顯示，該基因在觸角、足中高表達，揭示其在蓮草直胸跳甲的化學感知過程中具有重要功能。后續擬開展包括RNA干擾、熒光競爭結合試驗等工作深入研究其功能。