桂花OfAP1基因的克隆及表達分析

蔣琦妮，付建新，張 超，董 彬，趙宏波

（浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300）

高等植物成花受到自身遺傳因素和外界環境因素的共同影響［1-2］。當植物完成成花誘導，花器官原基開始分化，逐漸形成花萼、花瓣、雄蕊和心皮等組織。在這期間，植物的莖尖分生組織形態發生了很大的變化，同時成花素FT（FLOWERING LOCUS T）的表達量顯著增加并參與調控花芽分化［3］。在模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana以及許多物種中已經證實，FT可以通過激活花芽分化組織特異性基因AP1（APETALA1）的表達促使植物完成開花進程［4］。過表達AP1基因，不論在長、短日照下擬南芥都會出現早花表型［5］，其突變體ap1則出現明顯的晚花表型［6］。在莖尖分生組織，AP1基因不僅在植物成花誘導的調控網絡中起核心作用，而且也決定花器官的形成。AP1基因是植物ABCDE分化模型中的A類基因，控制第一輪花萼和第二輪花被片組織的形成［7］，同時AP1也調控SEP3（SEPALLATA3）與LFY（LEAFY）基因的表達，促進花萼和花瓣的分化［8-9］。另外在擬南芥ap1突變體研究中發現，AP1突變會引起花器官的異常發育，如花萼發育成葉片、花瓣缺失等［10-11］。人們已從多種觀賞植物中分離得到了AP1基因，并且對多個物種的AP1基因進行了功能驗證和分析。超表達AP1及其同源基因都能促進開花，在擬南芥中異源表達百合Lilium longiflorum，蝴蝶蘭Phalaenopsis aphrodite以及山茶Camellia japonica的AP1同源基因都能引起早花現象［12-14］。同時，在擬南芥AP1突變體中異源表達百合，枇杷Eriobotrya japonica以及麻瘋樹Jatropha curcas中的AP1基因，都可以回補其突變體花器官缺陷的性狀［12，15-16］。桂花Osmanthus fragrans是中國十大傳統名花之一，也是常見的園林綠化樹種。按照開花習性不同，可分為秋桂和四季桂，秋桂僅在每年秋季開花，花序常為無總梗的聚傘花序［17］；關于其成花過程以及花芽分化和發育報道較少。木本植物桂花成花的機制與草本植物擬南芥等有一定差異。為深入了解桂花的成花機制，有必要分離成花相關基因并展開相關研究。本研究以秋桂品種 ‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’為材料，克隆桂花AP1基因（OfAP1），并對其序列進行生物信息學分析，同時運用熒光定量對其組織和時空表達進行分析，以明確OfAP1基因的基本特征和表達模式，為今后桂花的開花分子機理研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以盆栽 ‘堰虹桂’為材料，選取相同株齡且生長一致的植株。取桂花不同組織的樣品，包括根、莖、葉、葉芽、花芽、盛開期的花朵；同時根據桂花花芽分化進程取葉芽、花序分化期、花萼花瓣分化期、雌雄蕊分化期以及花開放不同階段圓珠期、鈴梗期、初花期、盛花期和盛花末期的樣品［18］，用于基因克隆、組織特異性和時空表達分析。所有材料使用液氮冷凍并于-80℃保存備用。

RNA提取試劑盒（RNAprep pure Plant Kit）購自天根公司（北京）。反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒、膠回收試劑盒、PremixTaq酶、pMD-18T載體和大腸埃希菌Escherichia coliDH5α均購自Takara公司（大連），運用實時熒光定量PCR（Applied Biosystems，Foster City，美國）分析OfAP1基因的組織特異性及時空表達變化。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄 按照RNAprep pure Plant Kit試劑盒說明書提取各樣品的總RNA，并參照Reverse Transcriptase M-MLV反轉錄酶說明書合成cDNA的第一鏈后，儲存于-20℃備用。

1.2.2 桂花OfAP1基因的克隆 利用前期轉錄組測序獲得的AP1 Unigene序列，設計特異性引物AP1-F： 5′-TAGAGTGAGAAAATGGGGAGA-3′；AP1-R： 5′-AATACAATCCCTGGCTACTT-3′。 以花芽分化期莖尖RNA反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為：上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，PremixTaqDNA 10 μL和去離子水7 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；然后進行35個循環，每個循環包括95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃保溫10 min，4℃保存。PCR反應產物經質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收、純化，與pMD18-T載體連接，轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，經PCR鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。1.2.3 序列生物信息學分析 對獲得的基因序列進行生物信息學分析，其中編碼區分析采用美國國家生物技術信息中心（NCBI）在線網站 ORFFinder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）， 編碼蛋白質的保守區段分析采用 NCBI Conserved Domain Search 軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），編碼區蛋白質特征分析采用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。多序列比對采用軟件DNAman，系統進化樹構建采用Clustal X+MEGA 7.0軟件并選擇鄰位連接法（neighbor joining method）用Bootstrap法檢驗1 000次。

1.2.4 實時熒光定量PCR 按照SYBRRPremix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒的說明書，檢測桂花OfAP1基因不同組織以及不同時期的表達情況。OfAP1定量引物為qAP1-F：5′-GCAGAAGTGGCTTTGATTTG-3′；qAP1-R：5′-GTTTGCTGGTGACTGAGGTT-3′。同時以 OfACT 為內參qACT-F：5′-CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT-3′；qACT-R： 5′-ACCCCATCACCAGAATCAAGAA-3′［19］。 qRT-PCR 反應體系： 2×SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus） 10 μL， 上下游定量引物（10 μmol·L-1）各 0.8 μL， cDNA 2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL， 雙蒸水補齊至 20 μL。 qRT-PCR 程序如下： 95 ℃預變性 30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。3次生物學重復。反應后根據熔解曲線分析qRT-PCR產物的特異性，并采用2-△△CT法計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 桂花OfAP1基因的克隆

以 ‘堰虹桂’花芽分化期cDNA為模板，擴增得到約750 bp片段（圖1），其開放閱讀框長為720 bp，編碼239個氨基酸（圖2）。該基因片段具有MADS-box基因的保守區，在NCBI上進行BLASTX在線分析，發現該序列與芝麻Sesamum indicum（AIS82596.1），葡萄Vitis vinifera（ACZ26528.1）和油橄欖Olea europaea（XP_022878350.1）等中AP1 基因的同源性最高，命名為OfAP1，并在GenBank注冊，登錄號為MH593222。

2.2 桂花OfAP1基因的氨基酸序列分析

OfAP1蛋白氨基酸序列運用NCBI在線CDD（Conserved Domain Datebase）分析發現，OfAP1具有典型的MEF2_like MADS結構域和K-box結構域，MADS結構域位于N端第2～74位氨基酸，K-box結構域位于第90～168位氨基酸（圖2）。OfAP1蛋白的分子式為C1199H1941N341O368S16，其相對分子質量為27 534.62，理論等電點為8.4。負電荷殘基總數（天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu）為32，正電荷殘基總數（精氨酸Arg+賴氨酸Lys）為35。在組成OfAP1蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占比例最高，為11.7%，其次為谷氨酸（Glu），占10.0%，色氨酸（Trp）所占比例最低，為0.8%。預測親水性指數（GRAVY）為-0.665，表明OfAP1具有較好的親水性。

圖1 桂花OfAP1電泳圖Figure 1 PCR products of OfAP1

圖2 桂花OfAP1氨基酸序列比對Figure 2 Comparative analysis of OfAP1 protein sequence

采用GOR4軟件對OfAP1蛋白二級結構預測發現，OfAP1蛋白二級結構由α螺旋、伸展鏈和無規則卷曲組成，其中，α螺旋（Hh）占56.49%，β折疊（Ee）占10.46%，無規則卷曲（Cc）占33.05%。同時采用Phyre 2在線工具對OfAP1蛋白三級結構進行預測，OfAP1有3個典型的α螺旋和2個β折疊（圖3）。NetPhos 2.0 Server預測結果表明：OfAP1蛋白序列中存在11個潛在的磷酸化位點，包括6個Ser位點（22Ser， 61Ser， 74Ser， 87Ser， 110Ser， 121Ser， 135Ser， 150Ser， 216Ser）和 1 個 Thr位點（220Thr）。NetNGlyc 1.0 Server預測結果表明：OfAP1蛋白存在1個潛在的N-糖基化位點，90Asn。

2.3 桂花OfAP1系統進化關系分析

為了分析OfAP1基因與其他物種中AP1基因的系統進化關系，采用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹（圖4）。單子葉植物（如短柄草Brachypodium distachyon，水稻Oryza sativa，玉米Zea mays）和雙子葉植物可以明顯地分為2個大類。桂花OfAP1與芝麻，豇豆Vigna unguiculata，枇杷，印加果Plukenetia volubilis，麻瘋樹，葡萄，芍藥Paeonia lactiflora，柑橘Citrus sinensis以及擬南芥中的AP1基因聚在一起，說明這些基因親緣關系較近且功能具有一定的相似性。

2.4 桂花OfAP1基因的組織特異性與時空表達分析

為明確OfAP1基因在桂花不同組織以及花芽分化不同時期的表達情況，對不同組織和器官（根、莖、葉、葉芽、花芽以及花）及不同發育時期的樣品進行熒光定量RT-PCR分析。結果表明：OfAP1基因在花芽中的表達量最高，其次為葉，在莖中的表達比較弱，在根中幾乎不表達（圖5）。同時，與葉芽時期相比，OfAP1基因在分化初期（即花原基的形成以及花萼花瓣分化期）表達量最高，隨后呈下降趨勢（圖6），到花開放階段表達量均較低。

圖3 桂花OfAP1蛋白的三級結構預測Figure 3 Tertiary structure prediction for OfAP1 protein

圖4 桂花OfAP1的系統進化樹Figure 4 Phylogenetic tree based on OfAP1 gene

圖5 OfAP1基因在不同組織中的表達量Figure 5 Expression of OfAP1 gene in different tissues

圖6 OfAP1基因在 ‘堰虹桂’成花及花開放過程的表達量Figure 6 Expression pattern of OfAP1 in flowers of different stages

3 討論

AP1及其同源基因已在多個物種中克隆得到，但桂花中的AP1至今沒有相關報道。本研究克隆得到OfAP1基因，發現其與芝麻、葡萄以及油橄欖等AP1基因高度相似，OfAP1氨基酸序列含有高度保守的MEF2_like MADS結構域和次級保守的K-box結構域以及可變C，MADS結構域具有結合DNA、蛋白質二聚化以及與其他因子結合的功能；K-box結構域的蛋白二級結構為3個α螺旋，具有介導蛋白-蛋白之間的相互作用［20］。AP1基因C末端的變化較大，但是不同類的MADS-box基因常含有一些保守的基序（motif），這些基序在蛋白復合體的形成和轉錄激活中起重要作用［21］。

開花是植物重要的發育階段，是多條基因網絡共同調控的復雜過程［2］。AP1基因是植物特有的MIKCC-Type MADS-box基因，既參與花分生組織的形成，又是花器官形成的重要基因，在植物成花中起關鍵調控作用［3］。根據在模式植物擬南芥中的研究，AP1是花分生組織形成的標志物，成花整合基因FT和SOC1能夠激活其表達并使其參與對成花抑制基因TFL1基因的拮抗，促進花分生組織的形成。在花器官發育中，AP1一方面通過促進AP3和PI的表達誘導花瓣和雄蕊的發育，另一方面受到AG基因的抑制作用控制萼片和花瓣的發育［22］。在百合中AP1的同源基因LMADS5/6轉基因擬南芥后發現其能夠造成早花，并且花器官中萼片變成心皮狀，花瓣變成雄蕊狀結構［12］；同樣地，在洋桔梗Eustoma grandiflorum中超表達AP1發現：轉基因植株花期提前，部分花瓣出現雄蕊類似的結構，進一步突變體互補實驗表明：AP1基因對花瓣形成，尤其是第2輪花被片的發育有重要作用［23］。在建蘭Cymbidium ensifolium，芍藥以及菊花Chrysanthemum morifolium等中，AP1基因在花芽中的表達量顯著高于其他器官組織，尤其在花芽分化的初期階段［24-26］。在桂花中，OfAP1在花芽中有較高的表達，其在花芽分化初期表達量顯著上調，尤其是成花轉變以及花瓣、花萼分化時期，而當完成花萼花瓣分化后，表達量則顯著下調。這充分說明桂花OfAP1基因參與了桂花成花轉變和花瓣、花萼等器官分化，但其具體作用機制還有待進一步通過轉化實驗加以驗證。