基于理化指標和風味成分的釀造米酒分類及其相關特性分析

鄒凌波，王棟*，余海燕，張立軍，徐巖

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(湖北廬陵王酒業有限責任公司，湖北 十堰，442100)

米酒是以稻米等谷物為主要原料，利用酒曲作為糖化發酵劑釀造而成的發酵酒，是中國的傳統酒精飲料[1]。我國米酒產地分布廣泛，具有悠久的歷史，主要有江浙地區的米酒、湖北的孝感米酒、房縣黃酒等。雖然長期以來，釀造米酒基本被看作是屬于黃酒的范疇，但在一些方面與中國傳統典型黃酒還是有明顯差異[2]，如釀造過程不添加麥曲作為糖化劑，因而米酒風味中沒有麥曲賦予的典型香氣和口感[3]，產品風味品質總體上似乎更接近日本的清酒[4]。

近年來，米酒越來越受到消費者的青睞，也引起了研究者的關注。中國米酒品類較多，但與黃酒[5]和日本清酒[6]較為完整的標準規范相比，米酒的生產及產品缺少系統的規范和標準，米酒品質參差不齊、難以客觀評價，這一狀況限制了米酒行業的進一步發展[7]。而米酒類型的合理劃分是品質評價的前提。目前國內現有米酒標準只有農業部的農業行業標準[8]和一些地方標準，這些標準主要根據酒糟形態等對米酒進行簡單的分類，難以反映不同種類米酒的內在品質特點。

近年來國內對米酒的研究主要集中在對米酒工藝[9]、米曲[10-13]的考察，或對某些地域性或特定原料米酒的分析[14-15]，而對于釀造米酒較為全面和系統的分類研究未見報道。本研究主要針對米酒中最主要的大米釀造米酒(不含其他輔料或添加劑的釀造酒及配制酒)進行分類及相關特性分析，為中國釀造米酒的分類提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 米酒樣品

選取江浙、湖北等地市售或生產廠家提供的10種典型的釀造米酒，另選擇2種不同的日本清酒樣品作為對照。

1.1.2 試劑

NaCl、NaOH、三氯乙酸：分析純，上海國藥集團；2-辛醇、無水乙醇：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器

高效液相色譜儀，美國Waters公司；氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司；pH計，瑞士Mettler Toledo公司；酶標儀，美國Bio Tek公司；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 米酒理化指標分析

米酒總酸、氨基態氮的測定方法參照黃酒國標GB/T 13662—2018[5]；

還原糖含量的測定采用DNS法[16]；

乙醇含量的測定采用高效液相色譜[17]。樣品處理：樣品經三氯乙酸沉淀后靜置0.5 h，取上清液用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，濾液供進樣。色譜條件：采用高效液相色譜儀(Waters 2695)測定，色譜柱為Aminex HPX-87H(150 mm×4.6 mm, Bio-Rad)，示差折光檢測器(RI)為Waters 2414，流動相為5 mmol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，進樣量 10 μL。

1.3.2 揮發性風味物質的測定

采用HS-SPME[18]結合GC-MS[19]的半定量測定方法。針對米酒特點，具體測定過程略有變化。

HS-SPME處理條件：酒樣經稀釋將乙醇體積分數降至2%，取9 mL置于頂空瓶中，用NaCl飽和，加入內標2-辛醇，進行頂空固相微萃取，萃取條件為：三相萃取頭DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)，50 ℃預熱5 min，萃取吸附45 min。

GC條件：進樣量1 μL，色譜柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速3 mL/min。升溫程序： 50 ℃保持2 min，以6 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持15 min。

MS條件： EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35.00～350.00 amu。

化合物的定性分析：未知化合物的質譜通過與NIST05a.L Database (Agilent Technologies Inc.) 進行比對。定性結果通過與標準樣品的質譜比對和查閱已經報道過的文獻中相應物質RI得到。

化合物的半定量分析：依據被檢測物質與內標物的濃度和吸收峰面積對應成比例求得[20]。

1.3.3 米酒口感的感官品評

米酒口感的感官品評參考GB/T 13662—2018[5]黃酒感官品評方法，由15名依照國際標準ISO—8586培訓過的品評員在獨立的品評間里進行品評。對米酒的基本口感特征評價按照5點標度法，分別對酸、甜、苦、鮮和澀味打分，0～5分別表示沒感覺、弱、稍弱、平均、稍強、強，最終評分取平均值。

1.4 數據分析

使用Excel 2016、XLSTAT 2014等軟件對實驗數據進行處理和統計分析。熱圖分析中對各風味成分含量進行Z分數(z-score)標準化處理后利用R語言進行繪制。

2 結果與分析

2.1 米酒基本理化指標及口感分析

釀造酒的理化指標可以反映酒的基本特性和品質，通常可根據少數幾個主要的指標對產品進行分類。參考日本清酒和已有的米酒標準[8]，選擇較能直接反映米酒釀造特性和品質的4項主要理化指標，即還原糖、乙醇體積分數、總酸和氨基酸態氮，首先對選取的10種典型米酒樣品及2種日本清酒進行檢測和分析，結果如表1所示。

表1 米酒及清酒樣品的主要理化指標Table 1 The physicochemical parameters of Mijiu and Sake samples

根據分析結果可以看出，由于釀造工藝及發酵條件控制等方面的差別，不同米酒理化指標差異明顯，尤其是在還原糖和酒精的含量上。酒樣中還原糖最低的僅為9.0 g/L，最高的可達292.6 g/L；酒精體積分數最低的僅2%左右，高的可以到達15%。根據黃酒和葡萄酒等釀造酒國家標準[5,21]，一般可根據理化指標中的含糖量對產品進行分類，當然，含糖量的分類標準并不一致。參考黃酒的含糖量分類標準[5]，嘗試對這些米酒樣品進行分類，則GC屬于干型(≤ 15.0 g/L)、SLMZQ為半干型(15.1～40.0 g/L)、GYLS、DL、CJ、LLWFX為半甜型(40.1～100.0 g/L)、SLCMJZ、SLMJXZ、MK、LLW1為甜型(>100.0 g/L)。2個日本清酒樣品如也按此分類，則HMH和HY分別為半干型和半甜型。

進一步對這些米酒樣品(包括清酒)進行口感(含口味)特征感官評價，分別對酒樣的酸、甜、苦、鮮、澀5種主要口感特征進行強度打分，評價結果如圖1所示。可以看出，各米酒樣品的口感特征差別較大。根據這種分類，即使同一類型的米酒口感差異也比較明顯，而不同類型的米酒卻具有類似的口感，如SLMZQ(半干型,圖1-a)、GYLS(半甜型,圖1-b)與大部分甜型米酒口感特征(圖1-c)類似，均具有較高的甜味及一定的酸味。

a-干和半干型米酒;b-半甜型米酒;c-甜型米酒圖1 米酒口感特征強度分析Fig.1 The intensity analysis of Mijiu taste characteristics

實際上，黃酒和葡萄酒等基于含糖量的分類，同時都對樣品酒精含量有一定的要求，如要求傳統黃酒、清爽型黃酒、葡萄酒的乙醇體積分數分別≥8.0%，6.0%或7.0%[5,21]。而中國米酒乙醇含量差異很大，如本研究的甜型米酒中最高和最低的乙醇體積分數差別超過13%，而且不少米酒乙醇體積分數<6.0%。此外，不同釀造酒含糖量的分類標準也不一致。由于米酒與黃酒產品特點不同，因此以黃酒(或者其他釀造酒)的含糖量分類標準直接用于米酒的分類可能并不太適合。

2.2 米酒的聚類分析

一般認為,目前國內的釀造米酒有如酒釀一類的甜型米酒及部分酒精度較高的純米酒之分，但沒有明確的界限標準。基于此，根據米酒還原糖和酒精含量,進一步利用XLSTAT分析軟件對樣品進行聚類分析，如圖2所示。

由圖2-a聚類分析結果可以看出，這些米酒大體可分為2類，即I類高度低糖型米酒和II類低度高糖型米酒。根據每類樣品的還原糖和酒精含量(如圖2-b所示)，I類高度低糖型米酒還原糖含量平均為50 g/L左右，大體類似于黃酒偏半甜的類型，酒精體積分數平均為14%左右；II類低度高糖型米酒還原糖含量平均為125 g/L左右，類似于黃酒的甜型酒，酒精體積分數平均為5%左右。這2類米酒樣品酒精含量范圍基本可以分開，但還原糖含量范圍有一定的重疊，特別是第II類米酒，其還原糖含量的范圍相對更為寬泛。這可能主要與米酒的釀造工藝不同及調配有關。2個日本清酒樣品也表現出和這2類米酒類似的還原糖和酒精含量的差異，可以認為分屬于這2個不同的類別。還原糖含量與酒精含量的關系實際上反映了酵母的發酵程度，較低的酒精度對應于較高的還原糖含量是容易理解的。總體而言，這樣的類型劃分基本反映了米酒的發酵程度。

a-聚類分析;b-兩類米酒的還原糖和酒精含量范圍圖2 基于米酒還原糖和酒精含量的分類分析Fig.2 Classification analysis of Mijiu based on the sugar and alcohol content

依照此種分類，對照圖1比較米酒的口感特征可以發現，第I類米酒口感特征仍然差異較大，表現出明顯的多樣性；第II類米酒基本包含了之前甜味較高、口感特征整體上比較接近的酒樣，如SLMZQ、GYLS、MK、SLCMJZ、SLMJXZ等。2個日本清酒樣品的口感特征總體較為柔和，但HY的甜味比較明顯，也分屬2類。這些結果說明，這樣的類型劃分也可以大體反映米酒的主要口感差異。

利用偏最小二乘回歸分析(partial least squares regression，PLSR)進一步對米酒口感特征和上述4項主要理化指標間的關系進行了考察。PLSR分析中，2個變量之間的距離說明兩者之間的相關性：位置越接近，正相關性越強；兩者在離圓心相反的位置，負相關性越強；兩者越垂直，越不相關[22]。PLSR分析結果如圖3所示。

圖3 米酒口感特征與理化指標的偏最小二乘回歸分析Fig.3 The PLSR analysis of taste characteristics and physicochemical parameters of samples

根據分析結果，在主要理化指標中，總酸含量與其他指標相關性不大，而還原糖含量與酒精和氨基態氮含量有一定的負相關性。如前所述，這是合理的，與米酒的發酵程度有關。在口感特征中，甜味與其他口感特征相關性不大，而酸味與澀、苦、鮮味有一定的負相關性。從圖3看出，總酸與酸味相關性較強，還原糖與甜味有一定的相關性，這容易理解。此外，氨基態氮含量可能也與米酒的苦味有一定的聯系。由酒樣的聚集程度，可以看出第II類米酒樣品比較靠近，與甜味和還原糖指標也較為接近，表明這些米酒更為相似，在口感上甜味特征較為明顯。而第I類米酒較為分散，表明了這類米酒的復雜性和多樣性。這與之前米酒的聚類分析及口感特性分析相一致。

從圖3中還可以發現，酒樣LLW1與其他酒樣距離較遠，性質較為獨特。按照還原糖含量，它屬于甜型米酒；而按照還原糖結合酒精含量的聚類分析，它屬于高度低糖型米酒。根據其理化指標(表1)，LLW1的還原糖、酒精含量及總酸均較高，可能是由特定工藝生產或調配而成，因而較為獨特。此外，中國米酒的地域特性并不明顯。

綜合以上結果，按照還原糖結合酒精含量將米酒大體上分為I類高度低糖型和II類低度高糖型兩類，比直接以還原糖含量進行分類似更合理。當然，隨著釀造新工藝及新產品的出現，類似LLW1的產品可以在此基礎上進行進一步的劃分。

2.3 米酒揮發性風味成分分析及類別特性

由于目前米酒香氣的感官評價術語體系尚未建立，米酒香氣特征不夠明確，本研究采用揮發性風味成分分析，考察不同米酒香氣物質特征，推測香氣品質的差異，進而進行香氣風格區分。利用GC-MS對12個酒樣中揮發性風味成分進行檢測，各酒樣含有的揮發性風味化合物種類和相對含量如表2所示。在12個酒樣中共檢測出46種主要揮發性成分，其中酯類化合物最多，15種；醇類10種；芳香族化合物10種；有機酸類5種；醛酮類4種；呋喃類1種；含硫化合物1種。

從表2可以看出，2類中國米酒的揮發性風味成分在種類上總體差別并不大，但含量有顯著差異。I類高度低糖型米酒除個別酒樣外，揮發性風味成分含量總體上要高于II類低度高糖型米酒，可能與較高的發酵程度，微生物代謝產物較豐富有關。II類米酒大部分都含有糠醛(呋喃類)和3-甲硫基-1-丙醇(含硫化合物)。糠醛的產生可能與此類米酒較高的糖含量有關，而3-甲硫基-1-丙醇會對香氣產生影響，值得進一步研究。此外，中國米酒的揮發性風味成分在種類上與清酒也沒有太大差異，但總體含量上卻遠少于清酒。如揮發性成分含量最少的米酒樣品SLCMJZ和SLMJXZ，其含量僅為清酒的約15%，特別是酯類和有機酸類物質，中國米酒的含量遠低于日本清酒。

基于米酒揮發性風味成分含量，對數據進行標準化處理后繪制熱圖(圖4)，嘗試對這些酒樣進行分類，并比較不同類別米酒的香氣物質特征與差異。

表2 米酒揮發性風味物質分析Table 2 Analysis of flavor components in Mijiu sample

注：a含量以μg/L計；b日本清酒樣品。

圖4 米酒揮發性風味成分熱圖分析Fig.4 The heat map of Mijiu’s flavor components

根據熱圖的聚類分析結果(圖4)，這些酒樣大體可分為3大類(用A、B、C表示)，且不同類別酒樣揮發性風味成分差異明顯。首先風味成分含量總體相對較高的3個米酒樣品(CJ、GC、LLW1)聚為一類(A類)，這些酒樣均為前述I類米酒。第二大類(B類)米酒樣品風味成分含量相對較低，樣品間差別也較大。其中II類米酒都屬于此類，也有少量I類米酒。另外，2個日本清酒雖然基本理化指標差異明顯，可看做是兩類產品，但根據揮發性風味物質兩者聚為一類(C類)，表明清酒香氣特征的相似性。

利用主成分分析進一步對各米酒揮發性風味成分進行了考察，結果如圖5所示。

圖5 米酒揮發性風味成分的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of volatile flavor components in Mijiu注：圖中風味成分的編號與圖4一致

根據主成分分析，除了樣品GYLS外，這些酒樣也可以分為3類，與熱圖的聚類分析結果(圖4)基本一致(以A、B′、C表示)。在A類酒樣中，雖然CJ、GC、LLW13種米酒有一定的差異，但其與高級醇及短鏈酯類化合物等較為相關，結合熱圖結果，其中丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯及苯乙酸乙酯等成分的含量較為豐富，因此其香氣可能較多地呈現出果香、花香和醇香等[23]。B'類酒樣相對較為集中，主要與醛類和呋喃類化合物較為相關，其中3-甲基丁醛、苯乙醛、糠醛(呋喃類)和乳酸異戊酯是此類米酒中含量相對較高的共有成分。C類仍然是2個日本清酒，相關的主要揮發性香氣成分以有機酸和酯類化合物為主，主要包括己酸、辛酸、癸酸和己酸乙酯等。

根據以上分析，不包括清酒，中國米酒基于揮發性風味成分的分類結果與僅按照還原糖含量的分類結果差異較大，但與基于還原糖結合酒精含量的分類結果有較好的相關性。比較A、B兩類中國米酒的劃分與之前基于還原糖結合酒精含量的I、II類型劃分，可以發現，A類米酒均屬于I類米酒，相關的主要風味成分如高級醇等與較高的發酵程度相關。而B′類米酒主要是II類米酒(除GYLS外)，也包括少量I類米酒(DL和LLWFX)。由表2可知，II類中國米酒風味成分總體含量較低，而GYLS是其中含量最高的樣品；相反，DL和LLWFX則是I類酒樣中風味成分總體含量最低的2個。除了釀造工藝的差異外，這些樣品也可能經過較大程度的調配勾兌，從而造成風味成分的明顯改變和類型差異。但總體而言，對中國米酒類型的這兩種劃分還是具有較好的相關性，高度低糖和低度高糖的米酒分類能大體對應米酒香氣和風格的差異。當然，結合主要風味成分還可以進行更細致的分類。米酒產品的地域特性仍然沒有發現。

另外，比較我國米酒和日本清酒在風味成分上的差異可以發現，日本清酒含有更多的揮發性酸類化合物(辛酸、己酸、癸酸等)，酯類物質的含量也遠高于中國米酒。其中乙酯類物質(己酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯等)，能給清酒帶來水果香、花香、蜂蜜香等令人愉悅的香氣[4,24]。酸味和香氣的協調也是清酒的一大特色[25-26]，這些感官特性是中國米酒較為欠缺的。中國米酒的高級醇(異丁醇、異戊醇)含量相對較高，特別是大部分I類米酒，過高的醇含量會給酒帶來雜醇油和酒精的氣息[24]。此外，部分中國米酒的醛酮類化合物含量相對較高，使得米酒的香氣更為復雜，一些不飽和醛可能會帶來較刺激的氣味[24]。

綜合以上結果，中國米酒根據揮發性風味成分分類與之前根據還原糖結合酒精含量的分類結果有較好的相關性。研究結果也說明中國米酒的特點可能主要與生產工藝相關，地域特性并不顯著。

3 結論

本研究對照日本清酒樣品，對10個具有不同典型性的中國釀造米酒進行了基本理化指標、口感特征及揮發性風味成分分析，研究了中國米酒可行的分類及其相關特性，探討了不同成分與米酒類型的關系。由于不同米酒較為寬泛的還原糖和酒精含量范圍及對應的口感特性差異，直接以還原糖含量進行類型劃分不太合適。基于米酒還原糖結合酒精含量的聚類分析結果，可以較明顯地將中國米酒分為I類高度低糖型和II類低度高糖型兩個類別。通過基本理化指標和口感特征的PLSR分析，能較明顯地看出各酒樣之間的口感差異與部分理化指標間的相關性。其中第II類米酒多為突出的甜味，口感大體較為接近；而I類米酒口感復雜而多樣。綜合分析，這一分類相對更為合理。

利用GC-MS對米酒樣品的揮發性香氣成分進一步進行了檢測，其中II類米酒的揮發性風味成分總體含量明顯較低。基于揮發性風味物質的相似性聚類，中國米酒與日本清酒可以較明顯地區分，并也可分為2大類：A類具有較高的醇類和酯類化合物含量，均為I類米酒；B類風味成分含量總體較少，但醛類和呋喃類化合物相對較為豐富，主要是II類米酒。這一分類結果與基于還原糖含量的分類結果差異較大，而與基于還原糖結合酒精含量的分類結果有較好的相關性。此外，與日本清酒相比，中國米酒的酸類和酯類化合物含量相差較多，可能會帶來水果香、花香等香氣的不足；中國米酒的高級醇含量相對較高，特別是I類米酒，也可能對米酒品質有一定影響。中國米酒的地域特性并不顯著。

基于以上研究結果，我國米酒可以基于還原糖結合酒精含量等主要指標進行基本的類別區分，可以大體對應米酒香氣和產品風格。當然，由于釀造技術的差異以及釀造新工藝、新產品的出現，可進行更細致的分類。本研究的分析方法和結果可以為中國釀造米酒的分類提供依據。