牦牛乳源嗜熱鏈球菌直投式發酵劑的制備及應用

劉剛，梁琪*，宋雪梅，張炎

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實驗室(甘肅農業大學)，甘肅 蘭州，730070)

牦牛乳是一種特有的天然綠色產品，營養成分高于普通牛乳，是乳制品加工的最優原料之一[1]。全世界牦牛存欄數為1 400多萬頭，其中中國大陸占90%以上[2]。對于牦牛乳乳制品，國內乳品企業的發酵菌種均來自國外科漢森和丹尼斯克2個公司，我國密切關注國內菌種及發酵劑的發展，因此，對牦牛乳特有乳酸菌及其發酵劑的研究至關重要。真空冷凍干燥后的菌株具備活菌數含量高、遺傳穩定性好等特點[3-4]，但冷凍干燥也會導致微生物活力降低甚至死亡[5-6]。菌株在真空冷凍干燥過程中，菌體細胞由于機械損傷、DNA損傷等受到不同程度傷害[7]，選擇適當的凍干保護劑，則可使菌株保留自身的生物活性和理化特征[8]。因此，在工業化生產中，合適的保護劑不僅能有效地保護菌株的效能，而且能提高乳酸菌發酵劑和發酵產品的質量，從而使企業和農戶增收增效。

本研究以甘肅藏區牦牛乳中篩選并誘變處理的嗜熱鏈球菌[9]為研究對象，研究凍干條件和保護劑對其影響，以期為乳品發酵工業應用，尤其是牦牛乳品工業的應用提供直投式發酵劑資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilesQ4F8，由甘肅省功能乳品工程實驗室分離純化，于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保藏；商業發酵劑(嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌)，丹尼斯克有限公司。

1.1.2 培養基

GM17培養基[10]：多聚蛋白胨5 g，植物蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，牛肉膏5 g，乳糖5 g，抗壞血酸鈉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO45 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH值為6.9±0.2，于121 ℃高溫滅菌20 min。

脫脂乳培養基：120 g/L的脫脂乳，于115 ℃下滅菌15 min。

1.1.3 試劑

脫脂乳(食品級)：完達山乳業股份有限公司；谷氨酸鈉、甘油、海藻糖、0.01 mol/L I2標準液、雙乙酰標準液、三氯乙酸、NaHSO3、淀粉、鄰苯二胺、NaCl、酚酞(分析純)：上海國藥集團。

緩沖劑A(pH 6.86)：Na2HPO4(11.876 g/L)溶液，KH2PO4(9.078 g/L)溶液，配制而成。

緩沖劑B(pH 6.0)：NaOH(0.1 mol/L)溶液，KH2PO4(0.2 mo1/L)溶液，配制而成。

緩沖劑C(pH 6.4)：KH2PO4(0.2 mo1/L)溶液，NaOH(0.2 mo1/L)溶液，配制而成。

1.2 儀器與設備

723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司； SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司； PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；紫外燈，南京華強電子有限公司；YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；LVDV-1數字旋轉黏度計，上海方瑞儀器有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司； FR224CN型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；BCD-539WF海爾家用電冰箱，青島海爾股份有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機，寧波生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株Q4F8生長特性的研究

將活化后的嗜熱鏈球菌Q4F8按3%的體積分數接種于GM17培養基，42 ℃恒溫培養，每2 h取樣，通過平板稀釋涂布法，測定菌液的活菌數，連續測定至24 h，以時間和活菌數作圖并繪制嗜熱鏈球菌的生長曲線。

1.3.2 緩沖劑對菌株生長特性影響

通過菌株Q4F8的生長曲線，得出菌株開始“自溶”的時間點T[11]。將菌株活化后，分別以1.5%體積分數的接種量接種于優化后的培養基中，于42 ℃恒溫培養，每隔2 h測定培養液的OD600值。從時間點T前2 h時為T1點，開始按照1.5%的量添加緩沖劑，此后每隔2 h添加1次，每次添加量為1.5%，直至菌落的OD值沒有明顯變化為止。

1.3.3 保護劑的配制

由于NaCl可影響糖代謝關鍵酶[12]，從而能調節菌體細胞的糖代謝活動。因此，選擇85 g/L的NaCl配制各個質量濃度梯度的凍干保護劑，滅菌后于4 ℃保藏，備用。其中，海藻糖和谷氨酸采用0.22 μm的微孔濾膜(有機相)過濾除菌，脫脂乳和甘油采用高溫高壓滅菌(115 ℃，15 min)。

1.3.4 發酵劑的制備

將菌株加入1.5%緩沖劑并發酵至對數后期，取發酵液離心(4 ℃)，離心后菌泥中加入適量生理鹽水溶解，將離心后的菌體和保護劑按1∶3(V/V)于旋渦振蕩器混勻后，冰箱中預處理8 h，立即放入滅菌的真空冷凍干燥設備中處理。

凍干前首先用體積分數75%的酒精噴灑冷凍干燥機進行滅菌處理，迅速將預凍樣品放入，進行抽真空冷凍24 h。真空冷凍干燥結束，對樣品進行真空封口包裝，4 ℃低溫保藏。加入與凍干前樣品等體積生理鹽水與菌粉復容，采用稀釋平板法測定菌落數，并計算存活率，如式(1)所示，試驗平行3次。

(1)

1.3.5 離心條件對菌泥得率的影響

取最優條件下培養的發酵液，裝入無菌離心管中，分別在4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 r/min條件下，離心10、15、20 min。用等量的無菌生理鹽水稀釋沉淀，測定菌落數，計算菌泥得率(如式2所示)。

(2)

式中：m為加入發酵液后離心管質量,g；m1為離心管空質量,g；m2為離心后棄去上清液離心管質量,g。

1.3.6 預凍溫度對菌株存活率影響

將制備好的菌懸液在42 ℃下放置30 min，分別在4、-20和-80 ℃下預凍8 h，以100 g/L脫脂乳為保護劑進行真空冷凍干燥，待菌液完全凍結后迅速轉移至滅菌冷凍干燥機進行凍干，測定菌株存活率。計算參照公式(1)。

1.3.7 凍干保護劑的篩選

1.3.7.1 單一凍干保護劑對存活率的影響

選擇不同濃度的脫脂乳、甘油、海藻糖、谷氨酸鈉為保護劑，如表1所示，并測定菌株存活率。

表1 凍干保護劑試驗因素及水平Table 1 Factors and the levels of cryoprotectant

1.3.7.2 復合凍干保護劑正交試驗

按照L9(34)的試驗設計方案制備凍干菌粉的保護劑，計算凍干后菌體的存活率為篩選指標，選取保護劑最優配方。保護劑添加水平見表2。

表2 復合凍干保護劑正交試驗因素及水平Table 2 Factors and the levels of compound cryoprotectant

1.3.8 貯藏期發酵劑穩定性檢測

將制備好的凍干保護劑菌粉通過非真空和真空包裝，貯藏于-18、4和25 ℃，測定0、15、30、45、60、75和90 d后的活菌數。發酵劑中加入與凍干前等體積滅菌生理鹽水(85 g/L)復溶，搖勻后稀釋涂布計數，以活菌數為指標，研究貯藏期間發酵劑的穩定性。

1.3.9 凍干菌粉發酵性能驗證

常溫條件下，商業發酵劑和凍干菌粉用85 g/L滅菌生理鹽水復溶凍干菌粉30 min，復溶菌液按3%接種于半脫脂牦牛乳中(脂肪含量≥3.1%)，在42 ℃發酵直至凝乳。記錄凝乳時間,測定滴定酸度、活菌數、黏度和感官評價。

1.3.9.1 滴定酸度測定

參照GB 5009.239—2016 食品安全國家標準酚酞指示法測定滴定酸度。

1.3.9.2 活菌數測定

參照GB 4789.2—2016 食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數法測定。

1.3.9.3 黏度測定

采用LVDV-1數字旋轉黏度計，參數設置：選擇3號轉子，轉速為6 r/min。單位為Pa·s。

1.3.9.4 感官評價

發酵乳凝乳后于4 ℃冰箱貯藏24 h，由10人組成評價小組，對酸乳的色澤、風味和組織狀態進行描述及評分[13]。評價標準見表3。

表3 酸奶感官評分標準Table 3 Standard for sensory characteristics of yogurt

1.4 數據統計分析

本試驗數據均重復3次。采用Origin 2018軟件進行繪圖處理，SPSS 22.0軟件進行統計分析，采用鄧肯氏多重比較方法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株Q4F8的生長特性研究

對初始嗜熱鏈球菌菌株活菌數的生長指標進行測定。由圖1可以看出，0～4 h為該菌株的調整期，發酵液的各項指標基本保持一致。4～12 h進入對數期，菌體在適宜的生長環境下，其菌落數出現急劇增加的趨勢。發酵12 h時菌株達到自溶點(0T)。微生物自溶是菌體在不利環境中生存的一種方式，發酵乳中乳酸菌自溶，既破壞發酵劑成分，又使得乳酸菌活菌數降低，自溶分解的細胞質，將會改變發酵乳的感官性狀和生產周期[14-15]。

圖1 嗜熱鏈球菌Q4F8的生長曲線Fig.1 Growth curve of Streptococcus thermophilus Q4F8

2.2 緩沖劑對菌體生長特性的影響

由圖2可知，在菌株培養至自溶點時期添加不同緩沖劑，菌株活菌數都有不同程度的增殖，增殖情況由強到弱依次為：緩沖劑A>緩沖劑C>緩沖劑B。同一時期，不同緩沖劑對菌株的生長量全部呈現顯著性差異(P<0.05)，說明緩沖劑可緩解乳酸菌的自溶現象。在一定范圍內，緩沖劑可調節菌體自身產酸造成的影響，不同的環境條件對乳酸菌自溶程度和產品質構、風味產生不同影響[16-17]。因此，選擇pH為6.86的緩沖劑較為適宜。

圖2 緩沖劑對菌體生長特性的影響Fig.2 Effect of growth characteristic on cell注：a,b,c,d等不同字母表示試驗結果差異性顯著(P<0.05)。

2.3 離心條件的確定

由表4可知，隨著離心轉速和離心時間的增加，活菌數量和細胞存活率都呈現減小趨勢，而菌泥得率呈現增長趨勢。離心力越大對菌體的損傷越大，離心時間對菌體造成的損傷小于離心力造成的損傷，根據菌泥得率的趨勢變化，在6 000 r/min離心10 min之后的菌泥得率變化不明顯(P>0.05)且細胞存活率較高達到89.23%，故采用6 000 r/min離心10 min后收集菌體，得到菌體的最大收集量。研究表明，不同離心條件和離心時間影響菌體的代謝產物含量、細胞的抗凍性和貯藏性能，而離心溫度對以上菌體的性能影響不顯著性[18-19]。

表4 離心條件的篩選試驗結果×10-10Table 4 The screen experimental result of conditions for centrifuging

注：A,B,C,D等不同字母表示試驗結果差異性及顯著(P<0.01)。

2.4 預凍溫度對菌株的影響

由圖3可知，凍干菌株的存活率隨著預凍溫度的增加不斷下降，但-80和-20 ℃變化不顯著(P>0.05)。考慮到資源和成本的節約，選擇-20 ℃作為該菌株的預凍溫度。說明-20 ℃預凍處理，可明顯提高凍干菌株的存活率，這與BRAVO[20]的報道相一致。乳酸菌直接冷凍會對其造成細胞膜的破壞和嚴重機械損傷，預凍溫度不僅影響菌體細胞內冰晶的大小，而且對菌體的干燥時間也有很大影響。因此，研究預凍處理是非常有必要的。低溫條件下，乳酸菌冷凍的處理直接影響菌株的活力，其活力受預凍溫度、時間和速率的影響較大[21-22]。

圖3 預凍溫度對菌株存活率的影響Fig.3 Effect of pre-freezing temperature on survival rate注：a,b,c,d等不同字母表示試驗結果差異性顯著(P<0.05)。

2.5 凍干保護劑的優化

2.5.1 單一凍干保護劑的優化篩選

由圖4可知，從菌體細胞存活率最大情況分析得知，當單一保護劑質量濃度分別為150 g/L脫脂乳、10 g/L的谷氨酸鈉、60 g/L的甘油和80 g/L的海藻糖時，其菌體細胞存活率最大。

脫脂乳是蛋白類保護劑，與菌體易形成多孔結構，在菌體表面形成保護層，減少菌體細胞表面積的暴露和細胞壁的損害[23-24]；谷氨酸鈉是抗氧化劑類保護劑，在冷凍干燥期間，乳酸菌會產生過氧化物自由基而導致細胞損傷，一定量的抗氧化劑可減輕細胞受到的損傷[25]，且谷氨酸鈉與水分子結合，水分子在凍干后可維持細胞生命活動，提高菌體存活率[26]；甘油是滲透性保護劑，可自由進入細胞壁和細胞膜，冷凍時與菌體成玻璃態，從而抑制細胞冰晶的形成，保護具體免受傷害[26]；海藻糖是糖類保護劑，其二糖形式效果最佳[27]，如海藻糖的羥基和蛋白質形成氫鍵，穩定了菌體蛋白結構，提高乳酸菌的存活率[28]。

雖然各保護劑對乳酸菌可達到一定的保護作用，但要達到最佳保護效果必須通過各保護劑之間的協同作用，共同保護菌體細胞以提高乳酸菌菌體的存活率。

圖4 單一凍干保護劑對菌株存活率的影響Fig.4 Effect of single protectant on survival rate注：不同字母表示差異性顯著(P<0.05)。

2.5.2 復合凍干保護劑的正交篩選

按單一保護劑選取的最佳添加比例進行正交試驗，正交試驗結果如表5所示。

表5 復合凍干保護劑L9(34)試驗結果Table 5 The results of orthogonal experimental design L9(34) on protectants

注：不同字母表示差異性顯著(P<0.05)。

表5結果表明，相較單一保護劑對嗜熱鏈球菌Q4F8菌株的存活率，復合保護劑具備更好的保護效果。符合保護劑能夠相互達到互補，協同效果增強，從表5可以看出，正交試驗得出的保護劑優化方案為：150 g/L脫脂乳、10 g/L的谷氨酸鈉、60 g/L的甘油和80 g/L的海藻糖，雖然單一保護劑的最佳效果和正交試驗一致，但通過正交試驗得出的菌株Q4F8的存活率為90.08%，正好驗證復合凍干保護劑是由單一保護劑相互間協同保護而作用的效果。正交試驗最優結果與未添加的保護劑的存活率相比菌株呈顯著性增加(無保護劑的凍干菌粉菌株存活率為21.16%)。

2.6 發酵劑貯藏穩定性研究

由圖5可知，在真空包裝和非真空條件下，發酵劑的貯藏穩定性存在明顯差異(P<0.05)。經90 d的儲藏，菌株在-18 ℃的真空條件下，其活菌數下降不明顯(P>0.05)。

圖5 發酵劑的儲藏穩定性Fig.5 Storage stabilitys of starter

冷凍干燥期間，微生物表面水分活度降低，有益于菌體細胞的熱穩定性，提高菌株的存活率[29]。儲藏凍干菌粉時，儲藏條件下的氣體組分，特別是氧含量對儲存效果有很大影響。當儲藏溫度高于玻璃化的轉化溫度時，分子間的運動空間增大，發生一系列反應，從而對菌體活力造成影響[30]。TCIXCIRA[31]研究發現，在氧氣存在的情況下，凍干菌細胞膜中的脂質會和氧氣發生氧化反應，嚴重影響菌粉儲存期間的穩定性，所以對凍干菌粉進行儲藏時，通常選擇真空包裝來避免氧化反應的發生。

2.7 發酵劑發酵特性研究

嗜熱鏈球菌凍干發酵劑和商業發酵劑對比結果如表6所示，由于凍干發酵劑為單菌株的直投式發酵劑，而商業發酵劑則是球菌與桿菌兩者的共生作用，較單一菌株加快了發酵進程，縮短了凝乳時間。由表6可知，雖然凝乳時間比商業發酵劑較長，但滴定酸度為89.790T和活菌數含量4.63 lgCFU/mL與商業發酵劑活菌數和滴定酸度之間不顯著(P>0.01)，馮家適用于商業化可能是由于實驗過程中發酵菌株活力及富集時的含量高，導致凍干發酵劑的滴定酸度和活菌數的增大。凍干發酵劑酸乳酸甜適中、黏度厚實、色澤呈乳白色組織細膩均勻、無乳清的析出，感官評價91.60分，其黏度值和感官評價均與商業發酵劑呈極顯著性差異(P<0.01)。風味物質一般在4 h左右產生，而酸乳的風味是由多種物質共同作用產生的結果[32]，因此，凍干發酵劑長時發酵的酸奶其風味更加濃厚。

表6 凍干發酵劑檢驗結果Table 6 Results of fermentation performance on freeze-dried starter culture

注：不同大寫字母表示每列數據間差異極顯著(P<0.01)。

3 結論

牦牛乳不僅在蛋白質、脂肪和乳糖等營養價值均高于其他牛乳，而且是乳制品加工的最優原料之一[33]，而牦牛乳中含有高產胞外多糖、產細菌素、耐酸和耐膽鹽等性能良好的乳酸菌菌群，但針對牦牛乳的直投式發酵劑卻無人問津，本研究將甘肅藏區牦牛乳酸奶中獲得的一株嗜熱鏈球菌[34]經誘變選育得到的高產EPS菌株進行功能性直投式發酵劑研究，通過凍干條件和保護劑的優良篩選，旨在開發用于牦牛乳酸奶的發酵劑。

通過正交試驗優化，得到最佳牦牛乳直投式發酵劑制備條件為：選擇pH為6.86的磷酸緩沖劑做緩沖劑培養、6 000 r/min離心10 min條件收集菌體、-20 ℃預凍處理和質量分數分別為150 g/L脫脂乳、10 g/L的谷氨酸鈉、60 g/L的甘油和80 g/L的海藻糖作復合保護劑組合條件。最終表明嗜熱鏈球菌單菌株發酵劑在牦牛乳發酵工業上具備良好的發酵特性，同時為功能性乳酸菌更好地服務于發酵工業和乳酸菌發酵劑的工業化制備與應用提供理論參考。