牦牛血抗氧化低聚肽制備工藝的優化及抗缺氧活性的初探

肖嵐，何佩云，謝巧，杜昕，李誠*

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(四川旅游學院 食品學院，四川 成都，610100)

通過酶解聯合發酵制備的肽粗提液的成分復雜，要實現有效的分離純化相對困難。目前，生物活性肽分離純化的主要手段包括超濾[1-2]、凝膠層析[3-4]、離子交換層析[5]、色譜[6-8]等，為實現純化目的，普遍采用多種分離手段聯用的方式。本研究的前期實驗以體外抗氧化指標作為評價體系，采用枯草芽孢桿菌(SICC1.197)聯合堿性蛋白酶制備出牦牛血抗氧化低聚肽，利用超濾離心將牦牛血低聚肽分離為分子量>10 kDa、5～10 kDa、<5 kDa三個組分，利用Sephadex G-25凝膠層析法對分子量<5 kDa的組分進一步分離得到4個組分，其中組分Ⅰ的·OH清除能力最高，IC50值為0.72 mg/mL[9]。本實驗通過測定組分Ⅰ的分子量分布發現其肽段主要分布在分子量<1 kDa范圍內，而超濾擁有無相變、能耗低、節約試劑、設備簡單等優點，并且能夠實現連續化分離并能縮短生產周期[10-12]。因此，本實驗擬采用<1 kDa超濾離心代替凝膠層析制備牦牛血抗氧化低聚肽，并對其體外抗氧化活性進行研究，以期獲得更簡便有效的牦牛血抗氧化低聚肽制備工藝。

缺氧對機體是一種緊張性刺激，影響機體各種代謝，特別是影響機體的氧化供能，最終會導致機體的心、腦等主要器官缺氧供能不足而死亡[13]。生物體在長期的進化過程中已形成了一套從環境中有效獲取氧的能力，然而機體對缺氧的適應能力是有限的，特別是嚴重缺氧以及急性嚴重缺氧時，機體往往來不及發揮適應機制便進入代謝障礙階段。因此采用一些抗缺氧保健食品(藥物)來改善機體抗缺氧能力是非常重要的。牦牛是散布在海拔3 000 m以上的特殊家畜，經過世代的自然選擇，牦牛顯示出對低氧環境極好的適應性，這可能與牦牛血液的特殊性有一定關系[14-16]。姚星辰等[17]報道牦牛活性蛋白具有顯著的延長抗缺氧時間的作用；李冬利等[18]報道黃牛血活性肽能顯著延長小鼠在常壓缺氧和特異性心肌缺氧條件下的存活時間。實驗組前期研究已證實，牦牛血低聚肽具有較好的抗氧化活性，而關于其新的適應癥——抗缺氧活性的相關報道在國內外比較鮮見。因此，本實驗擬對牦牛血抗氧化低聚肽的抗缺氧活性進行初探，為進一步開發利用牦牛血低聚肽奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛血，四川省大渡河食品有限公司；蛋白酶K，德國MERCK公司；堿性蛋白酶(酶活力為85.61 U/mg)，上海Kayon公司；枯草芽孢桿菌SICC1.197，四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；大豆低聚肽(分子量<1 kDa)，西安百川生物科技有限公司，樣品外觀為淺黃色粉末，蛋白質含量84.17%，其氨基酸組分見表1；紅景天膠囊(國食健字G20100243，規格為 400 mg/粒，每100 g含紅景天苷0.5 g)，北京同仁堂健康藥業股份有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

表1 大豆低聚肽的氨基酸含量Table 1 Amino acid content of soybean oligopeptides

1.2 儀器與設備

超濾管(<5 kDa)，德國Sartorius公司；超濾管(<1 kDa),美國Pall公司；H2050R臺式高速冷凍離心機,長沙湘儀離心機有限公司；QYC-2102C恒溫振蕩培養箱,上海福瑪實驗設備有限公司；UV Power紫外可見分光光度計,北京萊伯泰科儀器有限公司；移液槍,德國Brand公司；LGJ-50F冷凍干燥機,北京松源華興科技發展有限公司；A300自動氨基酸分析儀,德國曼默博爾公司；Mission血紅蛋白分析儀,艾康生物技術(杭州)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛血抗氧化低聚肽的制備及指標測定

1.3.1.1 培養基的配制與菌液制備

將枯草芽孢桿菌于活化培養基活化后，接種于種子培養基，35 ℃、135 r/min恒溫振蕩培養12 h，得到實驗用菌液(1×109/mL)，培養基配制參數如表2。

表2 培養基的配制 單位：g/L

1.3.1.2 菌酶聯合制備牦牛血抗氧化低聚肽

采用實驗組前期研究的菌酶聯合法[19-20]制備牦牛血抗氧化低聚肽。

將1.3.1.1制備的菌液以接種量2.5%(V/V)加入底物質量濃度為75 g/L的高壓滅菌(121 ℃，15 min)的牦牛血液中，經35 ℃、135 r/min、72 h恒溫振蕩培養，發酵結束后經高壓滅菌(121 ℃，15 min)，得到牦牛血發酵液。牦牛血發酵液冷卻后加入堿性蛋白酶，在酶底比190 U/g、pH 9.5、60 ℃、3 h的條件下進行酶解，酶解結束后經沸水水浴滅酶活10 min，得到牦牛血酶解液。將牦牛血酶解液在4 ℃條件下，6 000 r/min離心15 min，取上清液用0.45 μm濾膜抽濾去除菌體殘渣，再將濾液用5 kDa超濾管于4 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min后取上清液得到分子量<5 kDa牦牛血低聚肽；肽液用1 kDa超濾管于4 ℃條件下，4 000 r/min離心30 min后得到分子量 <1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽。

1.3.1.3 分子量分布的測定

樣品經0.2 mol/L NaNO3溶液稀釋后，過0.22 μm濾膜、超聲波脫氣15 min后定容，采用ELEOS System凝膠色譜儀，設定流速0.5 mL/min、柱溫20 ℃，運行ARTRAV軟件后過膜上機，取基線、定峰后分析可得GPC分子質量分布圖。

1.3.1.4 氨基酸組分的分析

采用A300自動氨基酸分析儀分析得氨基酸組分分析譜圖。

1.3.2 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的分析

1.3.2.1 體外抗氧化指標的測定

·OH清除率測定參照TIAN F等[21]的方法、抑制脂質過氧化能力參照CHEN NAIFU等[22]方法、還原力測定參照劉昭明等[23]的方法、ABTS+·清除率測定參照潘瑤等[24]的方法、DPPH·清除率測定參照朱夕波等[25]的方法、總抗氧化力測定參照YANG M等[26]的方法。半抑制濃度( IC50) 值的測定參考杜昕等[19-20]的方法。

1.3.2.2 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的驗證

采用蒸餾水代替牦牛血，其他步驟同 1.3.1.2，制備發酵液、酶解液以及<1 kDa低聚肽，分別測定其·OH清除率。按照 1.3.1.1 的方法制備枯草芽孢桿菌菌液；按照酶底比190 U/g將堿性蛋白酶溶解在蒸餾水中；將75 g牦牛血液溶解在1 L蒸餾水，分別測定其·OH清除率。

1.3.2.3 蛋白酶K驗證實驗

分別將分子量<1 kDa 的牦牛血抗氧化肽凍干粉以及分子量<5 kDa的牦牛血抗氧化肽凍干粉配制成質量濃度為5 mg/mL的溶液，加入質量濃度100 μg/mL的蛋白酶K溶液，混勻后置于55 ℃下恒溫水浴2 h后，測定其·OH清除率，以探討牦牛血抗氧化低聚肽的肽段所發揮的抗氧化活性。

1.3.3 牦牛血抗氧化低聚肽耐缺氧活性的初探

SPF級KM小鼠，雄性，體質量18～22 g，購自成都達碩實驗動物中心，動物合格證號: SCXK(川)2015-030。將小鼠隨機分為5組，即空白對照組(等體積的生理鹽水)、紅景天陽性藥物組以及牦牛血低聚肽低、中、高劑量組(365、700、1 500 mg/kg )。灌胃30 d，1 次/d，自由攝食和飲水，灌胃后觀察小鼠的精神狀態、活動、覓食量等指標。

根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2003版)》中“功能學評價程序與檢驗方法”進行常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗。受試樣品組與對照組比較，存活時間延長，并具有統計學意義，則判定該實驗結果陽性。

小鼠Hb含量測定：自每只小鼠眼眶內眥靜脈叢采血，采用Mission 血紅蛋白分析儀檢測全血Hb含量。按Mission血紅蛋白分析儀說明書進行操作。

隨著電氣企業不斷加強對電氣自動化技術的優化升級，促使電氣自動化控制設備越來越被廣泛應用。當前大部分設備元器件生產企業在實際生產當中，由于缺乏嚴格的標準制度，并且這部分生產企業規模相對較小，在技術方面、生產經驗方面等嚴重不足，導致其生產出來的元器件價格相對較低。但是，這部分廠家所生產出來的元件質量方面沒有達標，不符合相關的質量標準要求，如果將該部分不合格的元件投入實際的生產當中，則必然會給電氣自動化設備造成嚴重的影響，并且對操作人員的人身安全造成威脅。

紅景天用量參照人用量(每日2次，每次3粒)進行換算，用蒸餾水溶解紅景天顆粒，配成質量濃度36.4 mg/mL的灌胃液，按10 mL/kg BW灌胃；對照組以蒸餾水灌胃。

1.4 數據處理

試驗數據經3次平行試驗后得到，通過方差分析(ANOVA)來檢測數據之間的差異性。統計分析使用Excel 2013、SPSS 16.0、Origin 8.1等軟件。

2 結果與分析

2.1 分子量分布

本實驗對峰Ⅰ組分進行分子量分布的檢測，結果如圖1和表3所示， 78.97%的肽段分布在<1 kDa的分子量段，這與文獻報道的絕大部分具有生理活性的肽段分子質量較小[27-29]相吻合。為了簡化牦牛血抗氧化低聚肽的制備工藝、方便大量制備，本實驗采用超濾分級的方法制備分子量<1 kDa的牦牛血抗氧化低聚肽。

表3 組分Ⅰ的分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of one component

2.2 牦牛血抗氧化低聚肽的氨基酸組成

對超濾分級得到的分子量<1 kDa的牦牛血抗氧化低聚肽進行氨基酸組分分析，結果見表4。分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽的氨基酸組成較為豐富，由13種氨基酸構成，氨基酸含量為85.25 g/100g。研究表明，大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如Val或Leu，并且序列中含有Pro、His[30]、Tyr、Trp[31]和Cys[32]等氨基酸。牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性可能與高含量的Leu、Pro以及Tyr有關。當然，除了氨基酸組成會影響抗氧化活性，肽段序列、一級結構以及活性位點也會影響其抗氧化活性[33]。

2.3 牦牛血抗氧化低聚肽體外抗氧化活性的分析

2.3.1 不同牦牛血抗氧化低聚肽對·OH的IC50值

由表5可知，超濾分級得到的分子量<1 kDa 牦牛血抗氧化低聚肽對·OH的IC50值為0.76 mg/mL,極顯著高于分子量< 5 kDa牦牛血低聚肽(P<0.01)。比Sephadex G-25分離純化得到的峰Ⅰ組分的·OH清除能力略差，但差異不顯著(P>0.05)，其清除·OH的IC50值為0.72 mg/mL。因此，采用超濾分級制備分子量<1 kDa 牦牛血抗氧化低聚肽是可行的。

表4 分子質量<1 kDa牦牛血低聚肽的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of yak blood oligopeptides with molecular weight less than 1 kDa

表5 不同牦牛血低聚肽對·OH的IC50值的比較Table 5 Comparison of IC50values of different yak blood oligopeptides on ·OH

2.3.2 分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽的體外抗氧化活性

牦牛血抗氧化低聚肽和大豆低聚肽體外抗氧化活性的 IC50值見表6。由表6可知，牦牛血抗氧化低聚肽的總抗氧化能力極顯著優于大豆低聚肽(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽的還原能力與大豆低聚肽差異不顯著(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽對脂質過氧化抑制能力、對·OH自由基的清除能力極顯著優于大豆低聚肽(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽對 DPPH· 的清除能力極顯著優于大豆低聚肽(P<0.01)；但是，牦牛血抗氧化低聚肽對 ABTS+· 的清除能力卻低于大豆低聚肽(P>0.05)。以上數據說明，本實驗制備的牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性優于商品化的大豆低聚肽，牦牛血抗氧化低聚肽具有作為天然抗氧化劑開發的潛力。

表6 兩種低聚肽體外抗氧化活性的IC50值Table 6 IC50 value of antioxidant activity of two oligopeptides in vitro

注：與大豆低聚肽相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3.3 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的驗證分析

圖1-A是堿性蛋白酶液、枯草芽孢桿菌液以及牦牛血對·OH的清除率。牦牛血的·OH清除率為19.14%，可能與血液本身含有抗氧化成分[14-16]有關；而堿性蛋白酶液和枯草芽孢桿菌液的·OH清除率較低，分別為8.57%和9.53%。此結果提示，堿性蛋白酶、枯草芽孢桿菌以及牦牛血本身的·OH的清除能力較弱。

圖1 制備工藝對牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of preparation process on antioxidant activity of yak blood antioxidant oligopeptides

如圖1-B所示，用蒸餾水代替牦牛血進行發酵、酶解以及<1 kDa超濾分級，得到的發酵液、酶解液、超濾液對·OH清除率分別為6.21%、9.59%、1.14%，而牦牛血的發酵液、酶解液以及<1 kDa 超濾液對·OH清除率分別為74.48%、93.62%、97.27%，差異極顯著(P<0.01)，實驗結果說明牦牛血蛋白質在發酵、酶解過程中形成的寡肽以及低聚肽貢獻了牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性。

為了進一步驗證牦牛血抗氧化低聚肽的肽段是其抗氧化活性的主要來源，實驗采用蛋白酶K對分子量<5 kDa和分子量<1 kDa 的牦牛血抗氧化低聚肽進行徹底水解，結果見圖1-C。分子量<5 kDa牦牛血抗氧化低聚肽(5 mg/mL)經蛋白酶K水解后對·OH清除率由95.89%下降到25.55%(P<0.01)，而分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽(5 mg/mL)經蛋白酶K水解后對·OH清除率由97.27%下降到24.23%(P<0.01)，可能是由于蛋白酶K水解低聚肽形成了較多的游離氨基酸，從而導致低聚肽對·OH清除能力的顯著下降。

綜上，牦牛血蛋白質經過枯草芽孢桿菌發酵以及堿性蛋白酶水解后得到的肽段是牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的主要來源，而枯草芽孢桿菌、堿性蛋白酶對牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性影響較小。

2.4 分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽抗缺氧活性的初探

對照組、陽性對照組(紅景天組)、牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組小鼠的體重變化見表7。表7顯示，小鼠適應性喂養一周后進行分組時的體重差異不存在統計學意義(P>0.05)，說明灌胃前的實驗小鼠的體重幾乎一致；灌胃30 d后，5組小鼠均較分組時的體重有不同幅度的提高，但是紅景天組和牦牛血抗氧化低聚肽高中低劑量組的小鼠體重增加幅度均低于對照組，特別是牦牛血抗氧化低聚肽高劑量組小鼠體重與對照組差異顯著(P<0.05)。可能是因為牦牛血抗氧化低聚肽具有苦味，劑量越大,苦味越重從而影響小鼠的自由攝食。如果開發保健食品或功能食品配料，建議可以采用微膠囊包埋技術解決牦牛血抗氧化低聚肽苦味的問題。

表7 牦牛血抗氧化低聚肽對小鼠體重的影響Table 7 Effect of yak blood antioxidant Oligopeptide on body weight of mice

注：與對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與紅景天組相比，*P<0.05，**P<0.01。下同。

由表8可知，對照組、紅景天組、牦牛血抗氧化低聚肽高中低劑量組小鼠灌胃30 d后空腹的血紅蛋白含量差異均不顯著(P>0.05)。經常壓耐缺氧實驗后，自每只小鼠眼眶內眥靜脈叢采血測定血紅蛋白含量，結果發現，陽性對照組(紅景天組)、牦牛血中劑量組與對照組差異顯著(P<0.05)；牦牛血低聚肽低劑量組與對照組差異不顯著(P>0.05)，高劑量組與對照組差異極顯著(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組與陽性對照組(紅景天組)差異不顯著。此結果提示，在缺氧條件下牦牛血抗氧化低聚肽中、高劑量組具有明顯的提高小鼠全血血紅蛋白含量的作用。

表8 牦牛血抗氧化低聚肽對小鼠Hb的影響 單位：g/L

缺氧對機體是一種緊張性刺激，影響機體各種代謝，特別是影響機體的氧化功能，最終會導致機體的心、腦等主要器官功能不足而死亡。牦牛血抗氧化低聚肽在常壓密閉缺氧過程中顯示了較高的抗缺氧活性，見表9。

表9 牦牛血抗氧化低聚肽對小鼠常壓缺氧存活時間的影響Table 9 Effects of yak blood antioxidative oligopeptides on the survival time of mice under normal pressure hypoxia

注：延長率=(藥物組存活時間-對照組存活時間)/對照組存活時間。下同。

與對照組比較，陽性對照組、牦牛血抗氧化低聚肽中、低劑量組雖然均能夠延長小鼠的存活時間，但無顯著性差異(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽高劑量組能顯著延長常壓缺氧小鼠的存活時間(P<0.05)；與陽性對照組比較，延長率達到了23.5%，差異極顯著(P<0.01)。

亞硝酸鈉使正常二價鐵血紅蛋白轉變成三價鐵血紅蛋白，破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織缺氧死亡。與對照組比較，紅景天陽性對照組雖然能夠延長小鼠的存活時間，但是無顯著性差異(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組均能延長缺氧小鼠的存活時間，高、中劑量組的小鼠存活時間延長率極顯著高于陽性對照組(P<0.01)。結果見表10。

表10 牦牛血抗氧化低聚肽對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間的影響Table 10 Effects of yak blood antioxidative oligopeptides on the survival time of sodium nitrite poisoning in mice

常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗的結果與對照組比較，存活時間延長并具有統計學意義，則可判定該實驗結果陽性，即適當劑量的牦牛血抗氧化低聚肽具有提高小鼠缺氧耐受力的作用。

3 討論與結論

1 kDa 超濾分級制備的牦牛血抗氧化低聚肽是1個低聚肽的混合物，其·OH清除能力、DPPH·清除能力、總抗氧化力以及脂質過氧化抑制能力均極顯著優于商品化大豆肽(P<0.01)。因此，菌酶發酵結合超濾分級制備牦牛血抗氧化低聚肽是可行的，且牦牛血抗氧化低聚肽可作為一種天然抗氧化劑做進一步的體內實驗研究。

缺氧會誘導機體氧敏感性途徑活化，催化線粒體通過Fenton反應和Haber-Weiss反應生成自由基[34]，影響機體正常的氧化分解供能作用。SCHREIBER等[35]發現維生素E和維生素C的自由基清除作用可以延長急性缺氧小鼠的存活時間。AL-HASHEM[36]發現補充維生素E和維生素C可以對抗高原缺氧引起的大鼠肺損傷。樊鵬程等[37]首次證實咪唑啉類自由基清除劑具有抗高原缺氧作用，其機制為清除減壓缺氧導致的體內過量ROS等自由基產生，即缺氧損傷的發生和線粒體內自由基釋放增加密切相關[38]。牦牛血抗氧化低聚肽具有良好的體外抗氧化活性，因此本實驗通過常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗初步探究了牦牛血抗氧化低聚肽的抗缺氧活性。常壓耐缺氧實驗結果顯示，不同劑量的牦牛血抗氧化低聚肽對小鼠常壓缺氧耐受力均有不同程度的提高，并呈現劑量依賴性。高劑量組能顯著延長常壓缺氧小鼠的存活時間(P<0.05)；亞硝酸鈉中毒存活實驗顯示，牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組均能延長缺氧小鼠的存活時間，高、中劑量組的存活時間延長率極顯著高于陽性對照組(P<0.01)。本研究結果提示，牦牛血抗氧化低聚肽具有提高小鼠抗缺氧應激的能力，可為抗缺氧保健食品做進一步研究。