冠突散囊菌發酵對荔枝草茶主要成分及風味的影響

楊立娜，吳凱為，徐清瑩，王如意，曲歌，吳昊桐，朱力杰，馬濤*

1(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州，121013)2(生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)3(遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧 錦州，121013)

荔枝草是一種來自民間的傳統小型中草藥，屬于唇形科植物[1]。廣泛分布于亞洲和大洋洲，尤其是在中國和印度的濕地中[2]。藥理學研究表明，荔枝草具有抗炎活性、抗病毒、保肝等活性作用，其粉末具有很強的抗氧化活性[3-6]，這和荔枝草中含有的茶多酚、氨基酸、茶色素、茶多糖有密切的關系。荔枝草一直以來被用于治療咳嗽、肝炎和腹瀉等炎癥疾病[7]，從荔枝草中可以分離出很多天然產品，包括黃酮類、木脂素類、二萜類化合物、倍半萜類化合物等,它們都具有廣泛的生物活性[8]。

冠突散囊菌是茯磚茶生產過程中產生的優勢菌種，具有降脂、抗氧化和抗腫瘤等生理活性[9-10]。在發酵過程中產生多種酶類，可以分解利用茶葉中的大分子物質，使活性成分發生復雜的變化，通過“發花”這道獨特的工序改善茯磚茶原有品質[11-12]。茶葉香氣作為評價茶葉好壞的一個重要指標，直接影響著茶葉的品質以及消費者的認可程度，在發酵過程中，冠突散囊菌產生特有的香氣物質，能有效地改善荔枝草發酵茶的感官品質[13]，研究中使用電子鼻和電子舌進行發酵前后荔枝草發酵茶的風味變化差異分析。本實驗采用冠突散囊菌固態發酵荔枝草的方法，對荔枝草發酵過程中主要活性成分及風味的變化進行研究，為進一步探討荔枝草茶品質形成機理并改善其品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝草原葉采購于市場；冠突散囊菌分離于大紅袍茶，經多代單菌落純化培養并測序鑒定，保藏在4 ℃冰箱待用。

Na2CO3、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4、草酸、葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、醋酸乙酯、95%乙醇、正丁醇、茚三酮、氯化亞錫、谷氨酸、蒽酮，天津市福晨化學試劑有限公司；福林酚，沒食子酸，北京索萊寶科技有限公司；濃H2SO4，天津市科密歐化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

改良查氏液體培養基[14]：NaNO33 g/L，K2HPO41 g/L, MgSO40.5 g/L, NaCl 50 g/L,蔗糖40 g/L，用蒸餾水充分攪拌使各成分溶解，加水定容至1 L，121 ℃高溫滅菌20 min，待用。以上各試劑均為分析純，購自天津市風船化學科技試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

THZ-D型臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠；LRH-150型生化培養箱、DHG-9055A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD型紫外潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZF-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；AR124CN型電子天平，沈陽杰龍儀器有限公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司；TDL-5-A型低速臺式大型離心機，上海安亭科學儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司；PEN3型便攜式電子鼻，德國Airsense公司；SA402B型電子舌，日本INSENT公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌孢子懸液的制備

將實驗室保藏的冠突散囊菌菌種復蘇，復壯，用接種環將菌刮下，在滅菌后的250 mL液體培養基中振蕩培養7 d，制備成濃度為1.0×107CFU/mL孢子懸液。

1.3.2 發酵茶的制備工藝

將處理好的荔枝草茶葉15 g置于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min[15]，放置20 min晾至室溫。加入一定量的冠突散囊菌孢子懸液，使茶葉充分濕潤，并在28 ℃的環境中進行固態發酵，發酵7 d后取出，在80 ℃烘箱內干燥2 h，制得成茶。具體技術流程如下：

鮮葉采摘→蒸煮殺青→揉捻→烘干→復水→滅菌→接種發酵→烘干→成茶

1.3.3 主要成分的測定

茶多酚的測定：參考GB/T 8313—2008茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法；氨基酸的測定：參考GB/T 8314—2013茶游離氨基酸總量的測定；茶色素的測定：系統分析法[16]；可溶性糖的測定：蒽酮-硫酸法[17]。

1.3.4 荔枝草茶發酵前后氣味的電子鼻檢測

荔枝草茶樣品前處理方法：準確稱取5.0 g(精確到0.01g)茶葉樣品于150 mL錐形瓶中，倒入100 mL事先煮沸的蒸餾水進行沖泡，使用封口膜將瓶口密封浸泡10 min后，取漏斗快速過濾得到澄清茶液，取10 mL澄清茶液于20 mL頂空瓶中，加入3.0 g NaCl，水浴鍋中70℃預熱25 min，每個茶樣做5個平行[18]。

電子鼻分析條件：測定時間為120 s，清洗時間110 s，樣品間隔1 s，傳感器室流量350 mL/min，測量樣品流量350 mL/min。PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述見表1[19]。

1.3.5 荔枝草茶發酵前后氣味的電子舌檢測

荔枝草茶樣品前處理方法：準確稱取5.0 g(精確到0.01 g)茶葉樣品于250 mL錐形瓶中，倒入250 mL事先煮沸的蒸餾水進行沖泡，使用封口膜將瓶口密封浸泡10 min，8層紗布過濾，濾液裝瓶密封，冷卻至室溫待測用[20]。電子舌分析條件：清洗時間5.5 min，傳感器自檢時間30 s，樣品測試時間30 s，測量回味30 s。SA402B型便捷式電子舌傳感器性能描述見表2。

表1 PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Properties of sensor on PEN3 electronic nose

表2 SA402B型便捷式電子舌傳感器性能描述Table 2 Properties of sensor on SA402B electronic tongue

1.4 數據處理

通過軟件SPSS19.0進行相關數據處理,每組試驗進行3次重復取平均值，數據以平均值±標準差表示，作圖利用OriginPro8.6與Excel2010進行處理，電子鼻的數據分析采用主成分分析和Loading分析。

2 結果與分析

2.1 不同發酵階段茶多酚含量的變化

由圖1可以看出，發酵前和發酵第2天茶多酚含量變化不顯著，隨后茶多酚含量呈下降趨勢且變化顯著，在發酵過程中，茶多酚含量由發酵前32.69%下降至22.27%，降幅為31.88%。有研究表明，茶葉的加工方式對茶葉中茶多酚含量有較大的影響，含量大小依次為：未發酵茶>微發酵茶>半發酵茶>全發酵茶[21]，因此荔枝草發酵茶中由于冠突散囊菌代謝旺盛，使得發酵后的荔枝草茶茶多酚含量明顯降低，此外，在發酵過程中冠突散囊菌產生多種胞外酶，在多酚氧化酶的作用下，茶葉中的多酚類物質被氧化成醌類[22]，使茶多酚含量下降，由此減少了荔枝草發酵茶的苦澀味。

圖1 不同發酵時間荔枝草茶中茶多酚含量變化Fig.1 Variations of tea polyphenols in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

2.2 不同發酵階段氨基酸含量的變化

由圖2可以看出，氨基酸含量呈顯著下降趨勢，發酵前期下降趨勢不明顯，隨時發酵時間的增長，氨基酸含量逐漸降低，由發酵前的4.79%下降至3.05%，降幅為36.3%。

圖2 不同發酵時間荔枝草茶中氨基酸含量變化Fig.2 Variations of amino acid in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

發酵過程中，氨基酸含量持續下降可能是因為在發酵過程中，氨基酸為微生物提供生長所需的碳源或氮源被部分消耗，并且隨著荔枝草茶的發酵，氨基酸進一步發生脫羧和氧化脫氨生成醛類物質以及水解、縮合等反應，形成荔枝草發酵茶的香氣物質[23]，由此證明冠突散囊菌發酵荔枝草茶可以改善荔枝草茶本身的澀味，進一步提高其感官品質。

2.3 不同發酵階段茶色素含量的變化

由圖3-a和圖3-b可以看出，在發酵過程中茶黃素和茶紅素有著較為接近的變化趨勢，即在發酵第6天前，色素累計含量逐漸升高且增長越來越迅速，在發酵結束時，增長趨勢開始減緩，這是因為在發酵過程中，冠突散囊菌發酵產生的多酚氧化酶將茶多酚主要物質兒茶素氧化為醌類，再進一步縮聚形成茶黃素和茶紅素，因此發酵前期這2種色素增長較快[24]。由圖3-c可以看出，茶褐素的變化隨著發酵時間的增長不斷增加，且有加快的趨勢，這是因為發酵過程中茶黃素和茶紅素發生氧化聚合反應生成茶褐素，使得茶褐素的含量不斷增多，與此同時茶黃素和茶紅素的增長速度減緩[25]。在整個發酵過程中，3種茶色素含量有不同程度的提高，茶黃素增長3.02倍，茶紅素增長1.73倍，茶褐素增長1.29倍，這種變化也有效地改善了荔枝草發酵茶茶湯的感官品質。

a-茶黃素含量；b-茶紅素含量；c-茶褐素含量圖3 不同發酵時間荔枝草茶中茶色素含量變化Fig.3 Variations of tea pigments contents in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

2.4 不同發酵階段可溶性糖含量的變化

由圖4可以看出，在發酵過程中可溶性糖含量呈減少的趨勢，尤其在發酵前2 d，降幅最為明顯，此后下降趨勢減緩，發酵結束時，茶葉中可溶性糖含量由1.47%下降至1.1%，降幅達到25.17%。在發酵過程中冠突散囊菌產生多種胞外酶，包括纖維素酶和果膠酶，這些胞外酶將茶葉中的多糖分解為單糖，促進可溶性糖的溶出，為微生物的生長提供所需碳源[26]。

圖4 不同發酵時間荔枝草茶中可溶性糖含量變化Fig.4 Variations of soluble sugar in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

2.5 電子鼻分析荔枝草茶發酵前后風味的差異

圖5為未發酵、冠突散囊菌發酵荔枝草茶的主成分分析，對同一樣品進行多次取樣判斷檢測穩定性。其主成分1(PC1，90.64%)和主成分2(PC2，5.95%)的總貢獻率為96.59%，>90%，說明PC1和PC2包含很大的信息量，能夠反應所有性狀指標所提供的信息。從圖5可以看出，未發酵和發酵的荔枝草茶分布于不同的區域，說明電子鼻能良好地區分2種樣品。

圖5 荔枝草茶發酵前后的PCA分析Fig.5 PCA analysis of Salvia plebeia tea before and after fermentation

圖6為電子鼻10個傳感器分別對樣品的PCA主成分分析的貢獻率。R(2)傳感器對第1主成分區分貢獻率最大，是第1主成分的特征信號；R(9)傳感器對第2主成分區分貢獻率最大。根據各傳感器對不同物質的特異敏感度，說明氮氧化合物在荔枝草發酵茶中的貢獻率最大，而有機硫化物在茶葉香氣成分第2主成分中貢獻率最大。

圖6 荔枝草茶發酵前后Loading分析Fig.6 Loading analysis of Salvia plebeia tea before and after fermentation

2.6 電子舌分析荔枝草茶發酵前后風味的差異

本實驗使用的電子舌設備含有5個檢測探頭，分別為酸味(CAO)、苦味(COO)、澀味(AEI)、鮮味(AAE)、咸味(CTO)，通過檢測后得到酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味、苦味回味、澀味回味、豐富度8組滋味指標[37]。由圖7可以看出，5個滋味傳感器對發酵前后2種茶葉均有響應，但敏感度略有差異，苦味、澀味、咸味傳感器響應值較為明顯，鮮味和酸味傳感器響應值較低。發酵后代表茶葉感官的苦味和澀味響應值降低，這表明通過冠突散囊菌的發酵改善了荔枝草發酵茶的感官品質。

圖7 荔枝草茶發酵前后茶湯滋味雷達圖Fig.7 Radar plot of Salvia plebeia tea flavor before and after fermentation

3 結論

對冠突散囊菌發酵的荔枝草發酵茶不同階段的主要成分及風味變化進行研究，結果表明，在荔枝草發酵過程中，茶多酚、氨基酸和可溶性糖含量變化規律相似，呈現隨發酵時間的增長逐漸降低的趨勢；茶黃素和茶紅素的變化規律相似，增長速率先增加后減緩，而茶褐素含量隨發酵時間的增長逐漸升高；在風味檢測中，發現發酵后苦味、澀味明顯降低，本實驗表明冠突散囊菌的生長使得茶葉中主要理化成分及風味物質發生了顯著地變化，有效地改善了荔枝草發酵茶的品質，為今后荔枝草發酵茶的進一步生產提供了理論依據。