紫薯花青苷定性分析及其主要花青苷的制備與抗氧化活性研究

韓豪，劉明慧，趙洋洋，劉洛樂，陳志遠，祁珊珊，梁引庫

1(陜西理工大學(xué)，陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中，723001) 2(寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 寶雞，721000)3(陜西理工大學(xué)，維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西 漢中，723001)

紫薯因富含花青苷而呈現(xiàn)紫色，花青苷不但具有鮮艷的色澤，還具有抗氧化、抗癌和抗炎等生物學(xué)活性[1-4]。自然界中花青苷主要有6大類500多種，基本結(jié)構(gòu)為3,5,7-三羥基-2-苯基并吡喃，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，A環(huán)上3,5碳位易與酚羥基、有機酸或糖形成醚鍵、苷鍵或發(fā)生?；磻?yīng)，成苷的糖類主要有葡萄糖、半乳糖和鼠李糖等單糖，還有蕓香糖和槐糖等二糖類，有機酸通過糖的酯酰結(jié)合形式存在，酰基化最常見的酸為咖啡酸、對羥基甲苯酸、芥子酸、阿魏酸和丙二酸等[5-9]。

據(jù)文獻報道，紫薯花青苷有矢車菊素、芍藥素和天竺葵素三類，主要為酰基花青苷[10-12]。紫薯花青苷的主要純化方法有溶劑萃取法、超濾法、大孔樹脂柱層析法和制備液相法[13-16]，前3種方法難以獲得高純度花青苷，制備液相法可以獲得高純度的花青苷，但是產(chǎn)量太低，加工成本較高，無法滿足花青苷生物活性的研究。由于紫薯花青苷種類較多，且純化技術(shù)不成熟，標準品較少，尤其是酰基花青苷標準品，從而制約了?；ㄇ嘬盏慕Y(jié)構(gòu)鑒定、以及?；ㄇ嘬丈锘钚院退幚韺W(xué)研究，使得紫薯花青苷的研究主要以粗提物為主[17-20]。

本研究擬采用超高效液相色譜—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對紫薯花青苷進行定性分析，并篩選出一套高效、低成本和污染小的純化技術(shù)對紫薯主要花青苷進行分離純化，并初步對其進行抗氧化活性評價。以期為解決?；ㄇ嘬諉误w的定性、生物活性和藥代動力學(xué)研究的瓶頸問題提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

紫薯(秦紫薯1號)，楊凌金薯種業(yè)有限公司。維生素C(Vc)、矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-glu)、飛燕草素-3-葡萄糖苷(Dp-3-glu)和芍藥素-3-葡萄糖苷(Pn-3-glu)標準品，標準品的含量均≥98%，Sigma公司。

1.1.2 主要試劑

色譜純甲酸、乙腈和甲醇，霍尼韋爾公司；福林酚和DPPH，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

ACQUITY TQD超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國waters；玻璃層析柱，江蘇三愛斯科學(xué)儀器有限公司；UV2550紫外可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國艾卡公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫薯花青苷粗提物的制備

將1 kg新鮮紫薯去皮后，切成厚度2～4 mm，于45 ℃下鼓風干燥，粉碎后過篩40目分子篩，得到120 g紫薯粉，加入體積分數(shù)60%乙醇溶液1 000 mL，常溫超聲提取60 min，重復(fù)操作2次，合并所得上清液，離心，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將上清液濃縮至小體積，采用低溫冷凍干燥后，得到紫薯花青苷粗提物21.6 g，放置于-18 ℃保存，備用。

1.2.2 定性和定量方法

UPLC-MS/MS的色譜和質(zhì)譜參數(shù)，采用文獻[21]中色譜和質(zhì)譜參數(shù)。

準確稱取5 mg凍干的樣品，用體積分數(shù)6%甲酸水溶液溶解，并定容于25 mL的容量瓶中，再用0.2 μm的針頭過濾器過濾，于UPLC-MS/MS測定。

采用超高效液相色譜柱分離，在530 nm處檢測，質(zhì)譜中的全掃描、多反應(yīng)檢測模式、子離子掃描和母離子掃描等掃描方式，確定待測物的質(zhì)荷比、準分子離子和特征碎片離子，再與文獻比對，從而對樣品進行初步的定性分析。

以芍藥素-3-葡萄糖苷為標準品，采用外標法對不同柱層析方法純化后的樣品進行定量分析。準確稱取9.60 mg的芍藥素-3-葡萄糖苷標準品，用6%甲酸水溶液定容于25 mL的容量瓶，得到384 μg/mL的標準母液，將該溶液經(jīng)過逐級稀釋，可得到質(zhì)量濃度19.2、38.4、57.6、76.8和96 μg/mL芍藥素-3-葡萄糖苷標準溶液，采用UPLC-MS/MS檢測。

1.2.3 紫薯中主要花青苷的制備

稱取紫薯花青苷粗提物100 mg，置于活化后的AB-8大孔樹脂柱上，分別用2 000 mL純水、800 mL 20%乙醇、800 mL 40%乙醇和500 mL 60%乙醇洗脫，收集40%乙醇和60%乙醇洗脫的溶液，濃縮后，采用低溫冷凍干燥后，命名為AB-8-1；再采用聚酰胺玻璃層析柱對其進行純化，用2 000 mL無水乙醇溶液、1 000 mL 80%乙醇溶液洗脫，收集80%乙醇的部分洗脫液，濃縮并冷凍干燥后，命名為PA-1；最后采用葡聚糖凝膠玻璃層析柱進一步純化后，命名為Sep-1。采用UPLC-MS/MS對其進行定性和定量分析。

1.2.4 紫薯花青苷的抗氧化活性檢測

1.2.4.1 還原能力檢測

分別稱取紫薯花青苷粗提物、AB-8-1、Sep-1和芍藥素-3-葡萄糖苷各5 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL。分別量取800 μL樣品溶液和甲醇(空白)于比色管中，并加入3 mL稀釋10倍的福林酚試劑和3 mL 60 g/L NaHCO3溶液混合。在35 ℃水浴90 min后，在750 nm處使用紫外可見分光光度計檢測吸光度。

1.2.4.2 清除DPPH自由基活性檢測

DPPH乙醇溶液配制：取0.020 g DPPH溶于無水乙醇中，定容至250 mL，避光保存。

分別稱取紫薯花青苷粗提物、AB-8-1、Sep-1、芍藥素-3-葡萄糖苷和維生素C各5 mg，以體積分數(shù)50%的乙醇為溶劑，溶解并定容于50 mL容量瓶中。分別取編號為1、2、3三只試管，向1號管中加入3 mL 50%的乙醇溶液和3 mL DPPH乙醇溶液，命名為A1，向2管中加入3 mL樣品溶液和3 mL無水乙醇溶液，命名為A2，3號管中加入3 mL樣品溶液和3 mL DPPH乙醇溶液，命名為A3，搖勻后，避光放置30 min，在517 nm下測定吸光值。做3個平行樣，計算平均值和標準偏差。DPPH自由基清除率的計算見公式(1)：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯花青苷的主要成分分析

通過超高效液相色譜柱對紫薯花青苷粗提液進行分離，并用PDA檢測器在530 nm處進行測定，可得其主要花青苷有12種，如圖1所示。

圖1 紫薯花青苷粗提物色譜圖Fig.1 Chromatography of anthocyanins in purple sweet potato crude extracts

以矢車菊素類m/z287的特征離子峰，進行母離子掃描，結(jié)合530 nm處檢測到的色譜圖，得到5個矢車菊素類花青苷，保留時間分別為3.50 min(m/z449)、4.54 min(m/z949)、5.35 min(m/z935)、5.42 min(m/z1055)和5.80 min(m/z1111)。準分子離子[M]+為m/z449，特征碎片離子峰m/z287，通過標準品比對準確定性該化合物為矢車菊素-3-葡萄糖苷。

準分子離子m/z949，特征碎片離子峰m/z787、m/z449和m/z287。碎片離子m/z787，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子m/z449，[M-(176+324)]+即丟失了1個阿魏酰-槐糖苷；碎片離子m/z287，[M-(176+324)-162]+即丟失了1個3號位的阿魏酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖。推測其結(jié)構(gòu)為矢車菊素-3-(阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

準分子離子m/z935，特征碎片離子峰m/z773、m/z449和m/z287。碎片離子m/z773，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子449，[M-(162+324)]+即丟失了1個咖啡酰-槐糖苷；碎片離子287，[M-(162+324)-162]+即丟失了1個3號位的咖啡酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖。推測其結(jié)構(gòu)為矢車菊素-3-(咖啡酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

準分子離子m/z1 055，特征碎片離子峰m/z893、m/z449和m/z287。碎片離子m/z893，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子m/z449，[M-(162+120+324)]+即丟失了1個咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷；碎片離子m/z287，[M-(162+120+324)-162]+即丟失了1個3號位的咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖。推測其結(jié)構(gòu)為矢車菊素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

準分子離子m/z1 111,特征碎片離子峰m/z949、m/z449和m/z287。碎片離子m/z949，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖苷；碎片離子m/z449，[M-(162+176+324)]+即丟失了咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷；碎片離子m/z287，[M-(162+176+324)-162]+即丟失了1個3號位咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖苷。推測其結(jié)構(gòu)為矢車菊素-3-(咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

以芍藥素類m/z301的特征離子峰，進行母離子掃描，結(jié)合530 nm處檢測到的色譜圖，得到芍藥素類花青苷6個，保留時間分別為4.13 min(m/z463)、4.22 min(m/z907)、5.11 min(m/z963)、6.04 min(m/z949)、6.18 min(m/z1069)和6.75 min(m/z1125)。

準分子離子[M]+為m/z463，特征碎片離子峰m/z301，通過標準品比對準確定性該化合物為芍藥素-3-葡萄糖苷。

準分子離子[M]+為m/z907，特征碎片離子峰m/z745、m/z463、m/z301，碎片離子m/z745，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子463，[M-(120+324)]+即丟失了1個對-羥基苯甲酰-槐糖苷；碎片離子301，[M-(120+324)-162]+即丟失了1個3號位的對-羥基苯甲酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖。推測其結(jié)構(gòu)為芍藥素-3-(對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

準分子離子[M]+為m/z963，特征碎片離子峰m/z801、m/z463、m/z301，碎片離子m/z801，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子463，[M-(176+324)]+即丟失了1個阿魏酰-槐糖苷；碎片離子301，[M-(176+324)-162]+即丟失了1個3號位的阿魏酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖，推測其結(jié)構(gòu)為芍藥素-3-(阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

準分子離子[M]+為m/z949，特征碎片離子峰m/z787、m/z463、m/z301，碎片離子m/z787，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子m/z463，[M-(162+324)]+即丟失了1個咖啡酰-槐糖苷；碎片離子m/z301，[M-(162+324)-162]+即丟失了1個3號位的咖啡酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖。推測其結(jié)構(gòu)為芍藥素-3-(咖啡酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

準分子離子[M]+為m/z1 069，特征碎片離子峰m/z907、m/z463、m/z301，碎片離子m/z907，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子463，[M-(120+162+324)]+即丟失了1個咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷；碎片離子m/z301，[M-(120+162+324)-162]+即丟失了1個3號位的咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖。推測其結(jié)構(gòu)為芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷(Pn-3-[caf-(p-cou)-sop]-5-glu)。

準分子離子[M]+為m/z1 125，特征碎片離子峰m/z963、m/z463、m/z301，碎片離子m/z963，[M-162]+即丟失了1個葡萄糖；碎片離子m/z463，[M-(162+176+324)]+即丟失了1個咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷；碎片離子m/z301，[M-(162+176+324)-162]+即丟失了1個3號位的咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷和1個5號位葡萄糖。推測其結(jié)構(gòu)為芍藥素-3-(咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

以飛燕草素類m/z303的特征離子峰，進行母離子掃描，結(jié)合530 nm處檢測到的色譜圖，得到1個飛燕草素類花青苷，保留時間分別為3.17min。從其對應(yīng)質(zhì)譜圖，得到準分子離子[M]+為m/z465，特征碎片離子峰m/z303，通過標準品比對，可得該化合物為飛燕草素-3-葡萄糖苷。

綜上所述，經(jīng)檢測，紫薯中共含3類12種花青苷類物質(zhì)，如表1所示。

表1 紫薯花青苷的定性結(jié)果Table 1 Qualitative results of anthocyaninsin purple sweet potato

2.2 紫薯中主要花青苷的純化

通過對紫薯花青苷的定性分析，紫薯主要花青苷的保留時間為6.18 min，經(jīng)過初步定性分析為芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷。以芍藥素-3-葡萄糖苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標擬合標準工作曲線，回歸方程Y=7.381 1X-178.5(R2=0.999 86)。通過計算可得紫薯花青苷粗提液、AB-8-1和Sep-1中芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷的含量分別為38.9%、83.1%和98%。

2.3 紫薯主要花青苷抗氧化活性

由表2可知，芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷含量38.9%、83.1%和98%的3個樣品，其還原力分別為0.256、0.402和0.611，芍藥素-3-葡萄糖苷和Vc的還原能力為0.485和0.633。清除DPPH自由基能力分別為9.54%、34.2%和74.9%，芍藥素-3-葡萄糖苷和Vc清除DPPH自由基能力分別為45.5%和77.4%。還原力和清除DPPH自由基能力與芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷含量呈正相關(guān)，因此可初步判定紫薯主要抗氧化成分為花青苷類化合物。相同含量的芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷的抗氧化活性比對，得到相同苷元的?；ㄇ嘬盏幕钚愿哂诜酋；ㄇ嘬?，可見咖啡酸和對羥基苯甲酸有提高其酰基花青苷抗氧化活性的作用，且芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷的還原力和清除DPPH自由基能力接近Vc，可見該化合物具有較高的抗氧化活性。

表2 不同含量花青苷的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of anthocyanins in different contents

3 結(jié)論

本實驗從紫薯中檢測出3類12種花青苷類物質(zhì)，其苷元分別為飛燕草素、矢車菊素和芍藥素，其中飛燕草素類花青苷未見報道，在秦紫薯1號中未檢出天竺葵素類花青苷[10-12]。飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷通過標準品準確定性分析，其余9種為酰基花青苷，葡萄糖、槐糖是主要糖苷，阿魏酸、對-羥基苯甲酸和咖啡酸3種有機酸與槐糖發(fā)生?；磻?yīng)。

經(jīng)過柱層析法，AB-8大孔樹脂、聚酰胺和葡聚糖凝膠3種填料連用方法對紫薯中主要花青苷進行純化，芍藥素-3-(咖啡酰-對羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷經(jīng)純化后含量可達98%。本實驗所采用的大孔樹脂、聚酰胺、葡聚糖凝膠聯(lián)用技術(shù)純化花青苷類化合物，具有含量高、成本低和污染小的特點。

采用福林酚試劑法和清除DPPH自由基法，對比研究了不同層析填料純化后花青苷的抗氧化活性，結(jié)果表明，紫薯樣品中芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷的純度與抗氧化活性呈正相關(guān)，表明紫薯樣品的抗氧化活性主要是紫薯花青苷在起作用。相同含量的芍藥素-3-(咖啡酰-對-羥基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷和芍藥素-3-葡糖苷的抗氧化活性比對，得到相同苷元的?；ㄇ嘬盏幕钚愿哂诜酋；ㄇ嘬眨梢娍Х人岷蛯αu基苯甲酸有提高其酰基花青苷的抗氧化活性的作用。由于紫薯花青素具有多個酚羥基，且含有多個酰化基團，?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)中的弧對電子可以作為氫供體，因而具有清除活性氧自由基的能力，從而表現(xiàn)出較強的抗氧化性能[17-20]。糖苷鍵有利于提高花青苷的穩(wěn)定性，酰基花青苷與非?；ㄇ嘬障啾染哂薪Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抗氧化活性強的特點[22-26]，紫薯花青苷主要為酰基花青苷，因此在食品加工和保健品領(lǐng)域具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景。