熱水處理減輕采后黃瓜果實低溫貯藏冷害的條件優化

艾文婷，姜雪，張敏, 2, 3, 4*，邵婷婷，劉威，趙昱瑄，郝爽，厲建國

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海，201306)4(食品科學與工程國家級試驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306)

黃瓜原名胡瓜，又名剌瓜、青瓜，是葫蘆科一年生草本蔓生攀緣植物。黃瓜營養豐富、經濟價值高，其富含蛋白質、糖類、維生素、胡蘿卜素、尼克酸及鈣、磷、鐵、鉀等礦物質，長期食用可抗腫瘤、防衰老、防酒精中毒、降血糖、減肥強體。但黃瓜采后不易貯藏，是典型的冷敏易腐型果蔬，在普通冷藏環境或不適宜的低溫條件下極易發生冷害[1]。冷敏感型果蔬的冷害機理與控制研究一直是采后生理學研究的熱點之一。貯藏在低溫逆境下的果蔬，隨著冷害發生，表現出各種癥狀，主要為表皮凹陷、失去顏色、內外果皮有水漬狀斑點、果皮發生木質化和褐化、組織有裂縫等[2]。而且，冷害發生的表現與癥狀表現不同步，恢復到常溫條件后的果蔬比正常情況下腐爛得更快，即冷害隱蔽現象。果蔬冷害的發生，會導致膜脂由正常狀態下的流動液態鑲嵌相轉變為晶體固態相，細胞膜收縮，膜上出現龜裂和孔道，膜透性增強[3]，膜內大量可溶性物質及電解質等向膜外滲透，滲出的離子濃度增大，細胞膜組織的電解質滲透率升高[4-5]。而膜滲透率越大說明受到的冷害越重，因此電解質外滲率能夠作為評價果蔬受到冷害程度的指標，且比觀察冷害癥狀更為可靠。通過變溫處理[6-7]、貯前熱處理[8-13]等方法可以減輕冷敏型果蔬的冷害癥狀。而作為果蔬采后簡單物理處理方法之一的熱處理技術，對減輕長時間低溫冷藏造成的果蔬傷害、改善果蔬品質、延長其貯藏期等具有一定的效果[14-15]。吳光斌等[16]在研究枇杷冷害中發現，將枇杷果實熱激處理后貯于2 ℃～5 ℃的環境中能夠緩解由低溫引起的呼吸速率異常升高癥狀，推遲冷害癥狀的出現時間，增強細胞膜的抗冷性，冷害程度明顯減輕。喬勇進等[17]也發現，熱水處理可以減輕由低溫造成的膜傷害，維持膜的穩定性，延緩黃瓜細胞膜滲透率的增加，延緩和抑制冷害的發生。現今熱處理對冷敏型果蔬的影響研究已經較為成熟，但關于熱激處理中達到最佳效果的具體熱激溫度及熱激時間的研究卻并不常見。本研究在實驗室前期研究基礎上，對熱水處理減輕黃瓜冷害的最佳熱激溫度及熱激時間進行了研究。

本研究采用二次正交旋轉組合設計的試驗方法，能夠有效快速地確定多因子系統的最佳條件[18-19]，是一種應用較為廣泛的試驗優化方法，曾有多位學者將其用于提取工藝或配方的優化[20-22]，但該試驗方法用于果蔬冷害防治優化的研究還鮮見報道。本研究采用電解質外滲率作為黃瓜冷害程度指標值進行試驗的優化，采用二次正交旋轉組合設計，以熱激溫度、熱激時間及貯藏時間作為水平變量，優化黃瓜的最佳熱激處理條件，以期為黃瓜冷害的防治提供一定的試驗參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為“申青”黃瓜，購于上海市臨港新城大棚種植園。果實完全成熟，長度約(30±2) cm，直徑約(3.5±0.5) cm，單個果實的質量約為(200±20) g，果實飽滿無明顯機械損傷。將運回試驗室的黃瓜樣品進行適當的沖洗，分別于不同溫度(30～62 ℃)熱水中熱激一定時間(0～80 min)后，拭干，裝入厚約0.01 mm的聚乙烯薄膜包裝袋中，每袋3根，保持間距，在冷庫中(4 ℃，85%RH)貯藏0～12 d后用于黃瓜果實在低溫條件下電解質外滲率的試驗研究。每個處理組黃瓜30根，重復試驗。

1.2 測定方法

1.2.1 電解質滲透率的測定

參考解越等[23]電導率測定方法并作修改。使用切片器從黃瓜樣品中間部位切下3片厚度約為0.7 mm的均勻薄片，切取時應保證薄片厚度大小均勻一致并且盡量減少損傷。再使用打孔器從每片黃瓜薄片果肉部分打取面積約為0.25 cm2的5片組織圓片，分別放入已標記的燒杯中，依次加入20 mL去離子水，使樣品完全浸沒。將裝有樣品的燒杯置入轉速150 r/min、25 ℃的振蕩箱內振蕩10 min，待去離子水完全浸透樣品，用紗布過濾掉燒杯中的水，然后加入20 mL去離子水沖洗，如此反復3次，用濾紙吸干殘留在組織圓片表面中的水分，再次放入對應的燒杯中，加入20 mL去離子水，通過電導率測試儀測定樣品的初始電導率(R0)。然后將燒杯放入真空干燥器中，連接真空泵與真空表后進行抽氣，壓力控制在0.06～0.08 MPa，滲透時間30 min。之后將燒杯取出，使用保鮮膜和橡皮筋對燒杯進行封口后，再放入上述條件振蕩箱內振蕩1 h。待振蕩結束，取出燒杯，置于室溫條件下(20±2 ℃)靜置，測定樣品活體組織提取液的電導值(R)。最后用保鮮膜封口，于沸水中煮沸10 min后，再次冷卻至室溫，測定組織被完全殺死后的提取液的電導值(R′)。用公式(1)計算電解質外滲百分率(Y)。

(1)

式中：R，所測樣品活體組織提取液的電導值，μS/cm；R′，組織被完全殺死后提取液的電導值，μS/cm；R0，初始電導值，μS/cm。

1.2.2 冷害指數

將黃瓜樣品在室溫條件下(20±2 ℃)放置2 d后，測定其冷害指數。參考MARTNEZ-TéLLEZ M[24]的方法，根據癥狀將冷害現象分為5個等級：①0級，無冷害現象發生；②1級，冷害面積<1/4；③2級，冷害面積約為1/4～1/2；④3級，冷害面積約為1/2～3/4 ；⑤4級，冷害面積>3/4[25]。用公式(2)計算冷害指數。

(2)

1.3 試驗設計

對熱激溫度、熱激時間、貯藏時間進行單因素試驗，測定電解質外滲率，每個處理組含30根黃瓜樣品，取平均值。再以單因素試驗確定各因素水平范圍，利用三因素二次回歸正交旋轉組合試驗設計，優化得到減輕黃瓜冷害的最佳熱激處理條件。如表1所示，以熱激溫度、熱激時間和貯藏時間為試驗因素，對試驗因素水平編碼[27]。以電解質外滲百分率Y作為指標值，進行二次回歸正交旋轉組合試驗設計。將黃瓜按照表1中熱激時間及熱激溫度用熱水進行熱激處理，隨后將熱激后的黃瓜置于冷庫(4 ℃，RH85%)中貯藏，按時取樣，測定黃瓜指標值。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factor level code table

1.4 數據處理

運用SAS 9.1.3處理系統處理試驗數據并繪制等高線圖和響應面圖，采用Excel 2003進行折線圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 熱激溫度單因素試驗分析

在前期黃瓜熱激的預試驗中發現，當熱激溫度達到70 ℃以上時，黃瓜出現失水、皺縮變黃等現象，因此在熱激溫度單因素試驗中，從30～62 ℃范圍內選取了30、38、46、54、62 ℃的熱水，然后分別熱激30 min，處理后于4 ℃下貯藏5 d(第5天所有處理方式均發生不同程度的冷害現象)，測定黃瓜樣品的電解質外滲率。雖然冷害指數能夠較為直觀地表現出黃瓜果實受低溫脅迫傷害程度，但其有一定的滯后性，因此，同時觀察在室溫下放置2 d后的黃瓜樣品的冷害指數，與電解質外滲率指標值的趨勢進行比較。

如圖1所示，30、38、46、54、62 ℃的熱激處理下的黃瓜果實組織的電解質外滲率分別為(22.54±0.19)%，(18.42±0.12)%，(26.34±0.25)%，(28.32±0.17)%，(33.68±0.20)%。結果表明，黃瓜果實低溫逆境脅迫下的電解質外滲率的變化與熱激溫度有顯著關系(P<0.05)。電解質外滲率隨著溫度的升高先迅速降低后快速升高至緩慢增長，即受冷害程度隨熱激溫度先降低后升高。當用38 ℃熱激處理時，電解質外滲率最低。表2為不同熱激溫度對黃瓜冷害指數的影響。結果表明，黃瓜冷害指數變化也呈相似的變化趨勢，即隨著溫度的升高冷害指數先降低后升高，最后趨于平緩。由圖1可知，黃瓜樣品經38 ℃熱激處理后，受低溫傷害最小，與電解質外滲率的變化趨勢一致。

圖1 熱激溫度單因素試驗Fig.1 Single factor experiment of heat shock temperature

表2 不同熱激溫度對黃瓜冷害指數的影響Table 2 Chilling injury index of cucumber under different heat shock temperatures

注：表中數據為各組樣品“平均值±標準差”(n=30)；不同字母表示差異性顯著(P<0.05)。下同。

2.1.2 熱激時間單因素試驗分析

在38 ℃熱水中分別熱激黃瓜樣品0、20、40、60、80 min，然后于4 ℃下貯藏5 d，測定其電解質外滲率。并觀察計算在室溫下放置2 d后的黃瓜樣品的冷害指數，與電解質外滲率指標值的變化趨勢進行比較。

如圖2所示，當在38 ℃環境下熱處理0、20、40、60、80 min后，黃瓜果實組織的電解質外滲率分別為(27.31±0.21)%，(19.42±0.23)%，(22.54±0.17)%，(23.65±0.26)%，(29.46±0.12)%。由試驗結果可以看出，黃瓜果實低溫逆境脅迫下的電解質外滲率變化與熱激時間有顯著關系(P<0.05)。電解質外滲率隨熱激時間的增加先迅速降低后緩慢上升，即隨熱激時間的增加受冷害程度先下降后上升。當熱激時間為20 min時，電解質外滲率達到最低。

表3為不同熱激時間對黃瓜冷害指數的影響。結果表明，黃瓜冷害指數變化呈相似的變化趨勢，即先下降后上升。如圖2所示，黃瓜樣品在20 min熱激處理下，受低溫逆境傷害最小，與電解質外滲率的變化趨勢一致。

圖2 熱激時間單因素試驗Fig.2 Single factor experiment of heat shock time

表3 不同熱激時間對黃瓜冷害指數的影響Table 3 Chilling injury index of cucumber under different heat shock time

2.1.3 貯藏時間單因素試驗分析

在38 ℃熱水中熱激黃瓜樣品30 min后，將樣品放置在4 ℃下分別貯藏0、3、6、9、12 d，分別測定其電解質外滲率。并觀察在室溫下放置2 d后的黃瓜樣品的冷害指數，與電解質外滲率指標值的趨勢進行比較。

如圖3所示，將在38 ℃環境下熱激處理20 min后的黃瓜果實組織放置在4℃下，貯藏0、3、6、9、12 d，其電解質外滲率分別為(17.40±0.18)%，(24.29±0.16)%，(27.32±0.12)%，(29.34±0.24)%，(33.91±0.27)%。由試驗結果可以看出，黃瓜果實低溫逆境脅迫下的電解質外滲率變化與貯藏時間有顯著關系(P<0.05)。電解質外滲率隨著貯藏時間的增加持續升高，即隨貯藏時間的延長受冷害程度呈一直上升的趨勢。在整個周期中，電解質外滲率增長了94.89%。表4為不同貯藏時間對黃瓜冷害指數的影響。結果表明，黃瓜冷害指數變化呈相似的變化趨勢，即冷害指數隨著貯藏時間的延長，呈現上升趨勢。這表明隨著貯藏時間的增加，黃瓜樣品受低溫逆境傷害程度逐漸增大，與電解質外滲率的變化趨勢一致。這也進一步驗證了電解質外滲率作為評價冷害程度指標的可靠性。

圖3 貯藏時間單因素試驗Fig.3 Single factor experiment of storage time

貯藏天數/d036912冷害指數0a0a0.03±0.000 6b0.07±0.000 5c0.28±0.000 4d

2.2 二次回歸正交旋轉組合設計試驗數據分析

根據單因素試驗結果，以使電解質外滲率達到最低的處理條件為中心選取一定范圍作為二次回歸正交旋轉組合試驗設計的因素水平。根據上述結果選取30～50 ℃的熱激濕度，0～60 min的熱激時間，選取貯藏時間為0～10 d。采用3因素二次回歸正交旋轉組合設計方法，以電解質外滲百分率Y為指標值，進行試驗設計。貯藏期間，黃瓜果肉組織電解質外滲率的試驗結果見表5。

表5 二次正交旋轉組合設計及試驗結果Table 5 Quadratic regression orthogonal rotating combination design and experimental results

注:X1-熱激溫度，℃；X2-熱激時間，min;X3-貯藏時間，d。

經過SAS 9.1.3數據處理系統[28]，將所得數據采用二次回歸正交旋轉組合試驗統計方法進行擬合。表6～表7為回歸方程的方差分析、各項的方差分析和參數估計及顯著性分析[24]。

表6 試驗結果的方差分析Table 6 Variance analysis of the test

2.3 電解質外滲率數學回歸模型

表7 試驗二次回歸模型參數Table 7 Regression model parameters

根據表6所列方差分析，對回歸方程進行失擬項檢驗：F1F0.01(9，13)=4.19極顯著，P<0.001，說明回歸模型與實測值能較好的擬和，模型成立。

在σ=0.10顯著水平剔除不顯著項，得到的回歸方程為：

根據回歸方程繪制貯藏時間5 d，熱激溫度x1、熱激時間x2和貯藏時間x3對電解質外滲率Y影響的等高線圖和響應面曲線圖(圖4)。

圖4 指標值Y的等高線圖(a)與響應曲面圖(b)Fig.4 Contour plots(a) and response surface plots(b) of index value Y2

通過擬合分析，以電解質外滲率Y表征的黃瓜冷害指標，在熱激溫度由30 ～50 ℃，熱激時間0～60 min時達到最小值23.92%，優化處理結果為熱激溫度37.5 ℃、熱激時間24 min。按照最佳熱激處理條件對優化結果進行驗證，選取30根黃瓜樣品進行熱激處理，在第5天時測定電解質外滲率實測值為Y=25.13%，與理論值Y=23.92%較為接近，進一步驗證了數學回歸模型。而根據單因素試驗2.1.1的結果，38 ℃熱水處理30 min，于4 ℃冷庫中貯藏5 d再于室溫放置2 d后的冷害指數最低為0.03，驗證試驗于第5天時再置于室溫2 d后的冷害指數也為0.03，與實際試驗值一致，此實驗優化得到了減輕采后黃瓜冷害較佳的熱水處理組合。

3 結論與討論

熱激溫度、熱激時間及貯藏時間的單因素試驗表明，在熱激溫度30～62 ℃范圍內熱激30 min并于4 ℃下貯藏5 d，電解質外滲率隨溫度的升高先降低后升高；在38 ℃熱水中熱激0～80 min并于4 ℃下貯藏5 d，電解質外滲率隨熱激時間的增加先降低后上升；在38 ℃熱水中熱激30 min并于4 ℃下貯藏0～12 d，指標值電解質外滲率隨著貯藏時間的增加持續升高。即在30～62 ℃熱激溫度和0～80 min熱激時間范圍內，在其他條件不變的情況下，隨著熱激溫度或熱激時間的增加，黃瓜受害程度先降低后升高；隨貯藏時間的增加，黃瓜受害程度持續升高。這一現象與前人[17,31-33]對熱激黃瓜的研究結果相吻合。

根據三因素二次正交旋轉組合設計試驗結果表明通過最佳的熱水處理后，黃瓜在第5天的電解質外滲率計算值為23.92%，實測值為25.13%，在4 ℃冷庫中貯藏5 d，再于室溫下放置2 d后的冷害指數為0.03，這一結果遠遠低于MAO等[34]和NASEF等[35]所測黃瓜的冷害指數和電解質外滲率。從而驗證了該模型試驗結果較好，能夠改善黃瓜的貯藏品質與冷害現象。

適宜的熱激處理能對低溫貯藏下的供試黃瓜的貯藏品質起到改善作用，并對冷害防治起到較好效果。但是熱激處理對冷害防治的機理研究尚不明確，仍應從DNA、RNA以及蛋白質代謝、采后果蔬衰老機制及激素平衡等多方面進行深入系統的研究。