基于TG酶凝固的大豆蛋白凝膠生產工藝研究

孫 菁 ， 趙良忠 ，3，王 容 ，沈國祥

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南邵陽 422000；2.湖南省果蔬清潔加工工程技術研究中心，湖南邵陽 422000；3.豆制品加工技術湖南省應用基礎研究基地，湖南邵陽 422000）

谷氨酰胺轉氨酶（Transglutaminase，簡稱TG酶）是一種催化?；D移反應的轉移酶，蛋白質和肽鍵中谷氨酞胺殘基的γ-羧酰胺基為酞基供體[1-2]。不同來源的原料TG酶處理條件不一樣，如魚肉TG酶最適pH值7.5，最適溫度30℃；豚鼠肉TG酶最適pH值6.0，最適溫度50～65℃；微生物TG酶最適pH值6.0～7.0，最適溫度50℃[3-6]。目前，TG酶在肉制品、乳制品和植物蛋白制品加工及環保型膠黏劑等多方面均有應用[7-8]。在豆制品生產中常以TG酶作為凝固劑。

蛋白質經過解離、變性，暴露出用于分子間交聯的功能基團，在合適的條件下，相鄰的蛋白分子通過化學作用力結合到一起形成三維網絡結構，成為凝膠[9-10]。凝膠作用是蛋白質最重要的加工功能性質之一[11]，豆腐便是經過大豆蛋白凝膠加工而成[12]，加熱、酸、鹽和酶均可誘導形成大豆蛋白凝膠。大豆蛋白的主要蛋白組成是球蛋白，包括大豆豆球蛋白（glycinin） 和以主要7S球蛋白[13-16]形式存在β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）。大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量不僅是豆腐的品質指標[17]，還是反應大豆蛋白的凝固狀態、決定最終豆腐的質構特性。試驗以大豆蛋白凝膠保水性、水分含量和質構特性為指標，研究TG酶對大豆蛋白凝固特性的影響，探討TG酶對大豆蛋白凝膠品質的影響，為TG酶在豆制品中的應用提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白、TG酶，湖南君益福食品有限公司提供；氫氧化鈉標定液、酚酞、乙醇溶液、戊烯二醛溶液、OsO4溶液，均為分析純。

1.2 儀器與設備

臺式冷凍離心機，澳大利亞達卡米公司產品；LS型質構儀，美國阿美特克有限公司產品；MJ33型水分自動測定儀，梅特勒-托利多公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 凝膠制備

配制4%大豆蛋白溶液[18]，調節初始pH值，于95℃下水浴加熱10 min，冷卻至一定反應溫度加入TG酶，控制反應時間。

1.3.2 單因素試驗

（1）初始pH值條件試驗。分別調節大豆蛋白溶液初始pH值至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，固定反應溫度50℃，TG酶添加量0.2%，反應時間15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值對凝膠保水性、水分含量及質構特性的影響

（2） 反應溫度試驗。調節大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，分別設置反應溫度40，45，50，55，60℃，固定TG酶添加量0.2%，反應時間15 min，探究反應溫度對凝膠保水性、水分含量及質構特性的影響。

（3）TG酶添加量試驗。調節大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，設置反應溫度50℃，使TG酶添加量分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，反應時間15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值對凝膠保水性、水分含量及質構特性的影響。

（4） 反應時間試驗。調節大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，設置反應溫度50℃，固定TG酶添加量0.4%，控制反應時間分別為10，15，20，25，30 min，探究大豆蛋白反應時間對凝膠保水性、水分含量及質構特性的影響。

1.3.3 正交試驗

以單因素試驗結果為基礎，選擇初始pH值（A）、反應溫度（B）、TG酶添加量（C） 和反應時間（D）4個因素進行四因素三水平正交優化試驗，通過保水性和水分含量選出TG酶凝固條件最佳工藝組合。

1.3.4 凝膠腐保水性測定[19]

稱取3 g（精確到0.000 1 g） 凝膠樣品放置于底部墊有脫脂棉的離心管中，以轉速1 200 r/min離心10 min，離心后稱量上層凝膠的質量（W1），此后將此樣品置于105℃下干燥至恒質量（W0）。持水率計算公式為：

1.3.5 凝膠水分含量測定

稱取2 g樣品放置于水分自動測定儀，測定完成后記錄數據。

1.3.6 凝膠質構特性測定[20]

取凝膠中心部分切成長寬高分別1 cm正方體的樣品，采用二次壓縮方法測定質構。用P35圓柱形平底探頭，測前、測中、測后速度分別40，30，40 mm/s，下壓距離40%，停留時間5 s，觸發力0.05 N。同一個樣品選3個不同部分進行測試，取平均值。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0數據處理軟件對數據進行相關性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 初始pH值試驗

初始pH值對凝膠保水性和水分含量的影響見圖1，初始pH值對凝膠質構特性的影響見圖2。

圖1 初始pH值對凝膠保水性和水分含量的影響

圖2 初始pH值對凝膠質構特性的影響

如圖1所示，隨著初始pH值的增大，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量均呈先上升后下降的趨勢，在pH值5.0時有最大值，變化顯著。大豆蛋白在等電點（pH值4.2～4.6）附近迅速聚集沉淀，蛋白質分子之間有序性降低[21]。蛋白質分子可能更容易與水分子結合，進而包裹更多水分子。在TG酶的作用下大豆蛋白質分子內或分子間交聯作用加強，凝膠結構緊密，保水性提高，水分含量增大。TG酶的最適pH值為5～8時有較高活性，過于酸性的環境會使TG酶活性降低，從而降低TG酶與大豆蛋白分子之間的交聯作用，不利于大豆蛋白分子與水分子的結合。由圖2可知，硬度和咀嚼性隨著初始pH值的增大呈先增大后減小的趨勢，在初始pH值5.0時有最大值；彈性和內聚性變化趨勢不規律，在初始pH值4.5時有最大值。初始pH值與質構指標硬度、咀嚼性和內聚性有顯著性差異（p＜0.05），與彈性無顯著性差異。

2.2 反應溫度對凝膠品質的影響

反應溫度對凝膠保水性和水分含量的影響見圖3，反應溫度對凝膠質構的影響見圖4。

圖3 反應溫度對凝膠保水性和水分含量的影響

圖4 反應溫度對凝膠質構的影響

如圖3所示，隨著反應溫度的升高，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量變化一致，均呈先上升后下降的趨勢，在55℃時為最大值，變化顯著。大豆蛋白預先在95℃下水浴加熱10 min保證變性充分（蛋白質解熱溫度過高會發生熱降解，從而使蛋白質失去凝膠能力），使蛋白質的巰基基團及疏水區域大部分暴露出來[22]，加入TG酶后更容易發生交聯作用，大豆蛋白凝膠結構緊密，保水性好，水分含量高。TG酶的最適溫度在45～55℃，溫度過高TG酶活性下降，與蛋白質的交聯作用減弱，形成的凝膠結構部松散、保水性低。由圖4可知，硬度和咀嚼性隨著反應溫度的上升呈先增大后減小的趨勢，在反應溫度45℃時為最大值；彈性和內聚性變化趨勢不規律，在反應溫度50℃時為最大值。反應溫度與質構指標硬度、咀嚼性、彈性有顯著性差異（p＜0.05），與內聚性無顯著性差異。

2.3 TG酶添加量對凝膠品質的影響

TG酶添加量對凝膠保水性和水分含量的影響見圖5，TG酶添加量對凝膠質構的影響見圖6。

圖5 TG酶添加量對凝膠保水性和水分含量的影響

圖6 TG酶添加量對凝膠質構的影響

如圖5所示，隨著TG酶添加量的增大，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量先緩慢上升，在0.4%有最大值，隨后下降，變化顯著。大豆蛋白穩定的空間結構由于TG酶發生交聯作用變得不穩定，暴露出的大量疏水區域在疏水作用下進一步交聯聚集，從而形成凝膠。但Sakamoto H等人[23]研究發現，隨著TG酶添加量的增大，大豆蛋白質分子表面的作用位點可能很快被交聯而降低了TG酶與蛋白分子交聯的幾率[24]，從而形成的蛋白質分子間凝膠結構少而松散。松散的結構使蛋白凝膠的保水性相對降低，水分含量減少。由圖6可知，硬度和咀嚼性隨著TG酶添加量的增大呈先增大后減小的趨勢，在TG酶添加量0.4%時有最大值；彈性和內聚性變化趨勢不規律，在TG酶添加量0.5%時彈性有最大值。TG酶添加量與質構指標硬度和咀嚼性有顯著性差異（p＜0.05），與彈性和內聚性無顯著性差異。

2.4 反應時間對凝膠品質的影響

反應時間對凝膠保水性和水分含量的影響見圖7，反應時間對凝膠質構的影響見圖8。

圖8 反應時間對凝膠質構的影響

圖7 反應時間對凝膠保水性和水分含量的影響

如圖7所示，隨著反應時間的增加，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量先上升后下降，在20 min有最大值，變化顯著。充分的反應時間使TG酶催化蛋白質分子上酰基轉移完全，交聯作用加強凝膠結構趨于穩定緊密，保水性增大、水分含量增多。但Howell N K[25]的研究結果表明，凝固時間過長會使蛋白質分子上的巰基發生氧化，進而疏水作用減弱導致凝膠結構松散，保水性減小、水分含量減少。由圖8可知，硬度和咀嚼性隨著反應時間的增加呈先增大后減小的趨勢，在反應時間20 min時為最大值；彈性和內聚性變化趨勢不規律，在反應時間25 min時為最大值。反應時間與質構指標硬度和咀嚼性有顯著性差異（p＜0.05），與彈性無顯著性差異。

2.5 正交試驗

正交試驗設計與結果見表1。

采用極差分析法，對各因素均值及極差大小進行分析。由表1可知，TG酶凝固大豆蛋白的4個條件對凝膠的保水性和水分含量影響程度相同，主次順序均為C＞A＞B＞D，即TG酶添加量＞初始pH值＞反應溫度＞反應時間，即最優組合為A2B2C3D2，按此組合進行驗證試驗，結果表明，A2B2C3D2組合下凝膠保水性為78.21%，水分含量為84.35%，結構緊致，故A2B2C3D2組合為最優組合，即初始pH值5.0，反應溫度55℃，TG酶添加量0.5%，反應時間20 min。

表1 正交試驗設計與結果

2.6 凝膠品質相關性分析

采用SPSS 22.0數據處理軟件對數據進行相關性分析。

凝膠品質相關性分析見表2。

根據表2進行凝膠品質相關性分析，保水性與水分含量呈極顯著正相關（r為0.785），即保水性越大凝膠水分含量越高，這是因為水分與蛋白網絡結構緊密結合不易流失；保水性與硬度和咀嚼性呈極顯著正相關（r分別為0.639，0.581），即保水性越大凝膠的硬度和咀嚼性越大，這是因為蛋白網絡空間結構包裹較多的水分導致硬度和咀嚼性增大。水分含量與硬度和咀嚼性呈極顯著正相關（r分別為0.653，0.581），即水分含量越高硬度和咀嚼性越好，這是因為水分含量會直接影響凝膠強度，進而影響凝膠的硬度和咀嚼性。硬度與咀嚼性、彈性和內聚性呈極顯著正相關（r分別為0.901，0.551，0.835），即硬度越大，咀嚼性、彈性和內聚性越好；咀嚼性與彈性和內聚性呈極顯著正相關（r分別為0.659，0.653），即咀嚼性越大，彈性和內聚性越好；彈性與內聚性呈顯著正相關（r為0.489），即彈性越大，內聚性越好。質構特性影響凝膠強度和蛋白質網絡空間結構，進而質構特性間相互影響。

表2 凝膠品質相關性分析

2.7 凝膠品質主成分分析

采用SPSS 22.0數據處理軟件對數據進行主成分分析。

凝膠品質主成分分析見表3。

表3 凝膠品質主成分分析

對凝膠品質進行主成分分析（principal components analysis，PCA），表3通過方差分解提取出2個主成分。第一主成分方差累積值能解釋凝膠品質信息的64.639%，第二主成分方差累積值能解釋凝膠品質信息的18.760%，一共反映了凝膠品質絕大部分信息83.399%。

主成分矩陣見表4。

表4 主成分矩陣

根據表4主成分矩陣分析，第一主成分與硬度和咀嚼性呈顯著性相關（相關系數r分別為0.965和0.922），且第一主成分可解釋凝膠品質信息的大部分，因此硬度和咀嚼性是決定凝膠品質的關鍵因素。

3 結論

傳統豆清發酵液生產條件與TG酶作用大豆蛋白的條件范圍有差異，試驗確定了TG酶凝固大豆蛋白的最優條件為初始pH值5.0，反應溫度55℃，TG酶添加量0.5%，反應時間20 min。通過對大豆蛋白凝膠品質進行相關性分析發現，除了硬度與彈性呈顯著相關，硬度和咀嚼性均與其他指標均呈極顯著相關；質構特性之間相關性十分復雜。通過主成分分析，確定硬度和咀嚼性是影響大豆蛋白凝膠品質的關鍵因素。