腸內營養對缺血性腦卒中患者腸道菌群的影響

范春江，劉庭玉，李剛，黃建，曹揚，黨旖旎

1.無錫市康復醫院（無錫市殘疾人康復中心）康復科，江蘇無錫市214043；2.復旦大學附屬中山醫院青浦分院消化內科，上海市201799；3.南京醫科大學第一附屬醫院（江蘇省人民醫院）消化內科，江蘇南京市210029

缺血性腦卒中是指由于腦部血液供應障礙，缺血、缺氧引起局限性腦組織缺血、壞死或腦軟化，具有發病率高、死亡率高、復發率高及致殘率高等特點[1]。我國腦卒中亞型中，近70%為缺血性腦卒中[2]?？祻椭委熢谌毖阅X卒中綜合治療中起著重要作用，對改善患者神經和肢體運動功能，提高生活質量起到積極作用。

消化康復是康復治療中的重要組成部分，經過嚴格規范的營養治療可以達到改善卒中患者預后的目的[3]。腸道微生態(gut microbiota)是腸道微生物與其宿主在進化過程中共同形成的統一體，與人類的健康息息相關。隨著人體腸道微生物群落基因組研究的不斷深入，越來越多的分子生物學證據揭示，腸道微生物群落不僅參與和調控機體的生理功能，還通過腸-腦軸影響缺血性腦卒中的預后[4]。

本研究旨在探討腸內營養是否可促進恢復期缺血性腦卒中的康復及其可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月20日至4月22日在無錫市殘疾人康復中心住院治療的恢復期缺血性腦卒中患者，符合1995年第四屆全國腦血管病會議制定的診斷標準，經頭顱CT或MRⅠ證實為缺血性腦卒中。

納入標準：①Fujishima評分[5]為1～6分；②能夠配合治療；③簽署知情同意書。

排除標準：①短暫性腦缺血發作；②蛛網膜下腔出血；③并發嚴重的內分泌和代謝性疾病；③并發嚴重的肝腎功能障礙；⑤并發慢性心肺功能不全；⑥并發消化道應激性潰瘍；⑦并發血液系統疾病；⑧并發惡性腫瘤；⑨接受溶栓治療；⑩入組前3個月內服用過益生菌制劑。

共121例患者入組，其中男性43例，女性78例，平均年齡為(79.6±9.43)歲；并發癥中以高血壓居多；卒中類型以TOAST分型Ⅲ型(小動脈閉塞性卒中或腔隙性卒中)為主(75.2%)，另有30例Ⅰ型(大動脈粥樣硬化性卒中)。見表1。

本研究經醫院倫理委員會審核批準(No.KFYYLL-001)。

表1 患者一般資料(n=121)

1.2 方法

1.2.1 常規治療

所有入組患者均予抗血小板凝集、抗凝及他汀類藥物治療。康復訓練包括偏癱肢體綜合訓練、運動治療、作業治療、吞咽功能訓練、中頻脈沖電治療和紅外線治療等。觀察期間持續治療。

1.2.2 腸內營養方案

取腸內營養混懸液(TPF，能全力，紐迪希亞制藥有限公司，批號H20010284)，以及由本院營養師依據患者體質量、營養狀況和病情配置高能營養液，熱量按每天83.68～125.52 kJ/kg提供。由專職護士負責，通過鼻飼管靜滴，滴速40～60 ml/h，若無腹瀉、腹脹、反流等不良反應，則持續注入。每天2次，每次500 ml。每3～4小時檢查胃潴留量，若大于150 ml，暫停腸內營養2～4 h。治療1周。

1.2.3 營養狀況評定

采用營養風險篩查表(Nutrition Risk Screening,NRS2002)對所有患者于入院時、干預后1周和1個月時分別進行營養狀況評定，同時檢測患者血漿蛋白和肝腎功能等指標。

1.2.4 腸道菌群檢測

囑患者在入院時、干預后1周和1個月時留取新鮮糞便標本約10 g。分離、提取、純化和檢測總DNA，行16SrDNA可變區PCR擴增和測序，最后進行菌種鑒定和生物信息學分析。

生物信息學分析包括：①數據統計，通過Ⅰllumina平臺(HiSeq或者MiSeq)進行Paired-end測序，下機數據經過去除低質量reads，每個樣本獲得Clean Data；②序列拼接，使用軟件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads,v1.2.11)，利用重疊關系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列，得到高變區的Tags；③物種分類和豐度分析，將經過上述處理的Clean Tags進行OTU聚類，然后通過對OTU注釋完成OTU的物種分類，并進行OTU及其豐度分析。

物種及其豐度分析采用observed species指數、chao指數和ace指數。它們反映患者腸道菌群中群落的豐度(species richness)，即簡單指群落中物種的數量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況。指數越高，說明標本中的物種越豐度。

多樣性分析采用Shannon指數和Simpson指數。它們反映群落的多樣性(species diversity)。受樣品群落中物種豐度(species richness)和物種均勻度(species evenness)的影響，在相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性。Shannon指數越高，說明標本中物種多樣性越大，Simpson指數越小說明標本中的物種多樣性越大。

1.2.5 炎癥因子檢測

采用酶聯免疫吸附試驗檢測炎癥因子。

囑患者在入院時、干預后1周和1個月時留取外周血，分離血清，凍存于-80℃待用。嚴格按照試劑盒(R&D公司)說明書進行操作，測量吸光度值，使用相關軟件繪制標準曲線，并計算血清樣本中腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,ⅠL)-1α、ⅠL-1β、ⅠL-6和ⅠL-8的含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 營養狀況

入院時患者營養風險評分為(3.4±1.26)分，血漿總蛋白和白蛋白分別為(66.13±5.21)g/L和(31.98±4.23)g/L。

干預后1周時營養風險評分為(3.3±1.38)分，與入院時相比接近，差異無統計學意義；血漿總蛋白和白蛋白分別為(67.89±6.52)g/L和(33.15±5.37)g/L，與入院時相比無明顯增高(P＞0.05)。

干預后1個月時營養風險評分為(2.9±1.69)分，與入院時相比下降(P＜0.05)；血漿總蛋白和白蛋白分別為(71.94±4.91)g/L和(36.86±3.59)g/L，與入院時相比增高(P＜0.05)。

2.2 腸道菌群

選取10例患者進行16SrDNA基因序列分析，以檢測腸道菌群。

2.2.1 腸道菌群OTU個數

在97%相似度下，得到每個樣品的OTU個數。OTU Venn圖可以顯示干預前后共有OTU數目以及各自特有OTU數目。入院時、干預后1周和1個月時患者OTU數目分別為599、1177和566?；颊呷朐簳r與1周時共有518個OTU，入院時與1個月時共有503個OTU，1周與1個月時共有510個OTU，而三組共有的OTU數目為465。見圖1。

圖1 腸內營養治療前后腸道菌群OTU Venn圖分析

2.2.2 腸道菌群物種

通過與數據庫比對，分別在門水平和種水平對OTU物種樣品做物種profiling面積圖和柱狀圖。見圖2。

在門水平，干預前優勢菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，共占細菌門類90%以上；干預后1周優勢菌門為擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和厚壁菌門，共占細菌門類95%以上；干預后1個月優勢菌門為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，共占細菌門類85%以上。

在種水平，大部分均為未分類菌種，其余菌種在干預前的優勢菌種為單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)和艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)等；干預后1周的優勢菌種為單形擬桿菌、大腸桿菌、卵形擬桿菌、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)和艾克曼菌等；干預后1個月的優勢菌種為脆弱擬桿菌、單形擬桿菌和艾克曼菌等。

2.2.3 腸道菌群多樣性

Alpha多樣性分析顯示，干預后1周時ace指數增高(P＜0.05)；1個月時observed species指數、chao指數和干預后指數較1周時降低，但仍高于入院時的數值；Shannon指數隨著干預時間逐漸增高，但無顯著性差異；Simpson指數在1周時最低(P＜0.05)。見圖3。

圖2 腸內營養治療前后腸道菌群物種分析

2.3 炎癥因子

干預后1周時與入院時相比，ⅠL-1β增高(P＜0.05)，血清ⅠL-8逐漸下降(P＜0.05)；其他無顯著性差異(P ＞ 0.05)。1個月時與入院時相比，ⅠL-1β和ⅠL-6增高(P ＜ 0.05)，血清ⅠL-8逐漸下降(P ＜ 0.05)；ⅠL-1α和TNF-α無顯著性差異(P＞0.05)。見圖4。

3 討論

《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》[6]中指出，腦卒中后嘔吐和吞咽困難可引起脫水和營養不良，導致神經功能恢復減慢。應重視腦卒中后液體和營養狀況評估，必要時給予補液和營養支持?！?005年美國急性缺血性卒中早期治療指南》[7]中同樣推薦，對住院腦卒中患者應進行營養基線評定，并采取措施糾正或改善營養障礙。

本研究結果顯示，腸內營養治療可能通過改變腸道微生態，調控炎癥因子水平，可能有利于促進缺血性腦卒中患者的預后。

腦卒中后營養干預管理在我國腦卒中規范化康復中應該引起重視。本研究發現，經過腸內干預后1個月時，營養風險評分下降，血漿總蛋白和白蛋白增高。

Beamer等[8]的研究顯示，腦卒中患者應在入院后48 h內進行營養狀況篩查，任何患者存在營養不良或者進食困難時都應給予營養治療，可有利于神經功能恢復?；颊呒覍傥桂B飲食內容隨意，無法根據患者營養狀況及時供給，造成營養狀況持續惡化，可能會導致病情加重。

圖3 腸內營養治療前后腸道菌群Alpha多樣性分析

圖4 營養治療前后血清炎癥因子的變化

本研究還發現，實施營養治療1周時，少數患者營養狀況有小幅度下降，提示腸內營養可能并未完全達到營養需求目標。Dávalos等[9]同樣發現，在缺血性腦卒中患者中，早期營養治療1周后，發現其營養狀況并未明顯改善。可能與腦卒中引起腦干和下丘腦功能紊亂，造成神經內分泌異常，以及腸黏膜屏障損害造成腸道吸收功能下降，導致營養攝入障礙等有關。這需要在以后的研究中進一步探索。

采用16SrDNA基因序列分析檢測腸道菌群后發現，不同干預時間點OTU個數有變化，且從門水平和種水平上，菌群都有變化。

本研究結果顯示，干預1周時ace指數增高；1個月后observed species指數、chao指數和ace指數較1周時降低，但仍高于入院時數值，提示干預前后腸道菌群豐度存在差異；Shannon指數隨著干預時間逐漸增高，但差異無統計學意義；Simpson指數1周時最低，提示干預前后腸道菌群多樣性存在差異，說明腸內營養治療可改變菌群的多樣性。也就是說，消化康復干預可以改變缺血性腦卒中患者腸道菌群的組成。Claesson等[10]同樣發現營養治療可以改變腸道菌群豐度。

而Goyal等[11]發現，腸道菌群多樣性和豐度不僅受飲食影響，還受年齡、性別、自身狀況、炎癥標志物、糞便中代謝產物等多種因素影響。

Singh等[12]發現，在誘導的缺血性腦卒中動物模型中，腸道菌群可以通過調節T細胞來影響炎癥因子水平，從而影響腦卒中的預后。

Kostulas等[13]研究發現，缺血性腦卒中患者ⅠL-8的增高趨勢，可能與ⅠL-8可趨化多形核白細胞聚集，加重腦細胞炎癥有關。臨床中也發現，患者血漿中ⅠL-1β和ⅠL-6有逐漸增高趨勢。多項研究認為[13-15]，這種增高趨勢可能加速腦細胞損傷，延遲患者神經功能恢復。

經過腸內營養治療，本研究中患者的ⅠL-8逐漸下降。提示營養治療可能通過免疫調節影響缺血性腦卒中的預后。

綜上所述，消化康復目前尚無明確的體系和具體的方案，通過研究腸道菌群，可為之提供理論依據。

本研究還需要從以下幾個方面改進：①增加更多的觀察指標，如功能評定量表等，進一步研究腸道菌群干預與功能改善和預后的關系；②擴大樣本量并延長隨訪時間；③消化康復是否需要采用腸內與腸外營養相結合的方式，腸內營養制劑的成分是否需要逐漸過渡等，仍需要進一步研究。