眶內電針法與眶內針刺法對大鼠動眼神經損傷后眼外肌功能及動眼神經的作用

滕金艷，胡少勇，汪澤棟

(1.湖北省中醫院針灸科，湖北 武漢 430074；2.湖北省中醫院神經外科，湖北 武漢 430074；3.溫州醫科大學附屬第一醫院針推理療科，浙江 溫州 325000)

動眼神經是第三腦神經，來源于胚胎中腦的基底板，通過上眶裂進入眼眶并支配外在眼肌，調控完成眼球轉動和抬閉眼瞼等動作[1]。動眼神經還包含支配內在眼肌的纖維，通過調控瞳孔收縮改變焦距以發揮調節視覺質量等作用[2]，其損傷會影響眼外肌功能。半乳糖凝集素-1(Galectin-1)[3]是半乳糖凝集素家族成員之一，研究發現其廣泛分布于神經系統，參與神經系統的發育，促進神經損傷后的保護，可用于成體神經性疾病預后的評估。本文旨在研究大鼠動眼神經損傷后，不同治療方案對眼外肌功能的影響及對動眼神經損傷修復作用，為動眼神經損傷修復提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型制備 選取體重>220 g成年雄性SD大鼠(許可證號：SYXK(鄂)2015—0029)，適應性飼養1周后制備動物模型。(1)暴露動眼神經：所有動物均經右側額顳入路暴露動眼神經。將大鼠麻醉后左側臥位，剃毛備皮，常規消毒、鋪巾，于耳前緣切L型切口，逐層切開皮膚、皮下組織、顳肌，雙極電凝血止血后，骨膜剝離器分離顳肌，將皮膚肌肉用牽開器向嘴耳連線兩邊撐開，高速磨鉆于暴露視野中央鉆孔，咬骨鉗將骨窗擴大約0.3 cm×0.2 cm，將顱底側硬腦膜懸吊，小心剪開硬腦膜，打開硬腦膜顯露腦組織后，用含8 萬IU慶大霉素的0.9%生理鹽水沖洗手術區，顯微鏡下用一逐漸變細的小腦壓板輕抬起梨狀葉，可見海綿竇后段游離于天幕緣的動眼神經。(2)動眼神經損傷：追蹤游離動眼神經干，并于海綿竇后段適當處，在顯微鏡下用槍狀鑷對動眼神經進行夾閉5 s，使軸突斷裂，但保持髓鞘完整，損傷完成后關閉手術窗，硬腦膜復位不縫合，骨窗覆蓋明膠海綿，然后逐層縫合顳肌，縫合皮膚。(3)動眼神經損傷模型成功標志：上瞼下垂、眼球外展位固定、眼球運動不能、瞳孔散大、瞳孔對光反射消失。(4)術后護理：術后7 d每天腹腔注射抗生素1次，術后2 d每天注射鎮痛藥。術后7 d皮膚傷口拆線。以上研究均符合動物倫理學研究標準。

1.1.2 動物分組 隨機選取模型制備成功大鼠21只，隨機分為模型組、眶內電針刺組(A組)、眶內針刺組(B組)各7 只，選取僅暴露動眼神經未進行動眼神經損傷SD大鼠7 只為假手術組，選取未進行任何手術處理的SD大鼠7 只為空白組。術后大鼠以平板托置，單籠飼養，自由攝食、飲水。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 空白組、假手術組、模型組不予治療，A組與B組均針刺內直肌、提上瞼肌。內直肌位于目內眥，將大鼠眼球向目外眥推壓，沿眼球與眶內壁之間近乎垂直進針，進針深度約0.3 cm；提上瞼肌位于眼球上方，將大鼠眼球向目下方推壓，沿眼球與眶內壁之間進針，進針深度約0.3 cm。A組分別以內直肌和提上瞼肌為電針導線的正負極，通以電流為5 Hz的連續波，強度以動物耐受、實驗者可見針體輕微極小幅度顫動為宜，在眼眶內、眼外肌周圍形成弱電場。B組內直肌與提上瞼肌各刺入2 根針灸針。每次治療15 min，每日治療1次，治療6 d間隔1 d為1個周期，共治療4個周期。

1.2.2 觀察指標 于治療結束次日檢測觀察以下指標。(1)瞳孔直徑：動物保持清醒狀態，在暗室內標準光刺激并記錄瞳孔直徑。頭部制動，用手術顯微鏡光束(強度230 000 lux，距離200 mm)直接照射瞳孔，并在眼休息位，垂直于眼球橫斷面拍照。采用Image-Pro Plus 5.0軟件測量患側瞳孔直徑。(2)瞼裂大小：動物保持清醒狀態，自然光條件下，雙眼處于休息位，垂直于眼眶平面采集圖像，用采用Image-Pro Plus 5.0軟件測量上、下瞼緣中點之間的距離，確定瞼裂大小。(3)眼外肌肌肉張力：采用肌肉張力換能器(肌肉張力換能器及生物信號采集系統，由成都泰盟科技有限公司提供，型號：LMSZ1002)檢測眼外肌肌肉張力，刺激頻率為10 HZ。(4)半乳糖凝集素-1(Galectin-1)mRNA表達：實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測動眼神經中Galectin-1 mRNA表達。RNAiso PlUS液提取總RNA；超紫外分光光度計測定RNA純度，以A260nm/A280 nm>1.8為純度合格；瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性，以可見紫外光檢測儀254 nm下，28 s與18 s兩條條帶的亮度比約為2：1為片段完整；合成cDNA，反應條件：37 ℃，5 min；37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min、4 ℃進行逆轉錄。引物序列：Galectin-1上游 5'-TCGTGTGCAACAGCAAGGACG-3'，下游5'-TTGGCCTGGTCGAAGGTGATG-3'，長度112bp，GAPDH序列：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，長度225 bp，PCR反應條件：95 ℃，5 min預熱；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，20 s擴增40 個循環；樣品10 倍梯度稀釋進行實時定量檢測，制作標準曲線，PCR反應條件：50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；熒光讀取Ct值；根據各樣品中的拷貝數，用內參作為校正，每個樣品均測量3次，取平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同治療方案對大鼠眼外肌功能的影響結果

與空白組相比，假手術組在瞳孔直徑、瞼裂、眼外肌張力方面差異無統計學意義(P>0.05)，模型組在瞳孔直徑、瞼裂、眼外肌張力方面差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，A組瞳孔直徑小于模型組、瞼裂及眼外肌張力大于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；B組瞳孔直徑小于模型組，差異無統計學意義(P>0.05)、瞼裂及眼外肌張力大于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同治療方案對大鼠眼外肌功能的影響結果

*P<0.05，與空白組相比；#P<0.05，與假手術組相比；△P<0.05，與模型組相比。

2.2 不同治療方案對大鼠動眼神經損傷的作用結果

由統計結果可知，與空白組相比，假手術組與模型組Galectin-1 mRNA相對表達量低于空白組，其中模型組差異有統計學意義(P<0.05)；與假手術組相比，A組與B組Galectin-1 mRNA相對表達量低于假手術組，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，A組與眶內針刺組Galectin-1 mRNA相對表達量高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 Galectin-1 mRNA表達量結果

*P<0.05與空白組相比；#P<0.05，與假手術組相比；△P<0.05，與模型組相比。

3 討論

動眼神經是支配眼球運動的重要神經，損傷后可引起眼球外觀、眼球活動以及視野等功能障礙[4-5]，嚴重影響患者的生活質量。動眼神經損傷的病因頗為復雜，包括顱內動脈瘤、顱內腫瘤、頭部外傷、眶內病變以及腦血管病變等[6]。Sheshadri等[7]研究發現，再生的神經纖維有助于恢復靶器官非特異性支配眼外肌的功能，但目前此觀點并沒有大量基礎研究數據證實。因此，動眼神經損傷后如何進行神經功能重建是目前醫學研究的難題。俞大雄等[8]研究發現，針刺療法可有效緩解動眼神經麻痹狀態，基于此，本文設計隨機對照實驗，評價不同治療方案對大鼠眼外肌功能的影響及對動眼神經損傷的修復作用。

本研究采用破壞動眼神經軸突的方式制備動物模型，因為該方法有外在創口，存在感染、手術復蘇失敗等導致動物死亡的可能，故選擇“先制備模型，后分組”的研究方法，以保證各組研究例數。在造模過程中動物頭部擺放姿勢、切口位置與大小、骨窗大小、術中顱內壓的控制及術后護理均為模型制備結果的影響因素。Galectin-1稱為β-半乳糖苷結合動物凝集素[9]，是一種周圍神經切斷后的修復因子，在神經元群中呈高表達狀態。研究[10]發現神經切斷術后Galectin-1 mRNA表達上調，作用類似于神經營養因子，且伴隨炎癥因子表達下降，表明Galectin-1通過促進增殖，增強軸突神經損傷再生修復功能。此外，Galectin-1 mRNA的上調可能會增加面部神經中的Galectin-1分泌，過多分泌的Galectin-1短暫氧化成為氧化Galectin-1，氧化Galectin-1是體內周圍神經損傷再生修復的必需物質[11]。眼外肌功能結果顯示，與空白組相比，模型組具有統計學意義，說明納入研究的動物模型制備成功，實驗結果具有可比性。眶內電針法與眶內針刺法與模型組相比均具有顯著差異，說明兩種方法可改善動物模型的眼外肌功能，但眶內電針法的瞳孔直徑低于眶內針刺組，瞼裂及眼外肌張力高于眶內針刺組，說明電針法對眼外肌功能的改善優于針刺法。動眼神經損傷的結果顯示眶內電針組與眶內針刺組Galectin-1 mRNA相對表達量均高于模型組，提示治療后動眼神經軸突或神經元增加。

有學者認為，Galectin-1可與小膠質細胞相互作用而起到促進神經功能恢復作用，小膠質細胞分為經典途徑激活的小膠質細胞(M1)和旁路途徑激活的小膠質細胞(M2)，M1被認為有神經破壞作用，而M2被認為有神經保護作用。Galectin-1通過PI3K途徑抑制M1的活化，上調M2的表型。本研究認為，針刺方法刺激自主神經，增加自主神經響應，而電針在針刺的基礎上結合電生理學，除了增加自主神經興奮性還可以調節神經遞質代謝，上調Galectin-1 mRNA表達量，利于神經損傷恢復。孫晉茜等[12]在研究視神經損傷修復時發現，電針法與針刺法均可改善動眼神經損傷，與本研究結果一致。

綜上所述，動眼神經損傷后修復是當前醫學研究熱點，眶內電針法與眶內針刺法均可通過上調Galectin-1 mRNA相對表達量，改善眼外肌功能，對動眼神經起到修復作用，為臨床修復動眼神經研究提供參考。