血管通透因子、DCC基因及MMP-9蛋白在胃癌患者中的表達(dá)水平研究

李程亮，辛宏，王敏娟，石穎鵬

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710077)

胃癌是臨床上較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國常見的惡性腫瘤中，胃癌發(fā)病率一直居于前列[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)每年會有接近100萬的胃癌死亡病例，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全。絕大多數(shù)胃癌患者早期無明顯癥狀，這也導(dǎo)致了目前我國胃癌的早期診斷率相對較低，因此如何提高胃癌早期診斷率是當(dāng)前許多學(xué)者主要的研究課題[2]。血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)作為一種誘導(dǎo)能力很強(qiáng)的因子，能夠刺激細(xì)胞的增殖、遷移，在腫瘤的形成中起到重要的作用；基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)蛋白能為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[3-4]；結(jié)直腸癌缺失 (deleted in colorectal cancer，DCC)基因是目前臨床上發(fā)現(xiàn)的最長的抑癌基因。本研究對VPF、DCC及MMP-9在胃癌癥狀中的表達(dá)進(jìn)行分析研究，旨在研究三者與胃癌癥狀發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年3月至2018年3月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢查確診并進(jìn)行手術(shù)治療的胃癌患者50例，其中包括男性30例，女性20例，年齡40～75歲，平均年齡(58.3±5.8)歲，腺癌患者18例，腺鱗癌患者16例，鱗癌患者13例，其他3例。排除標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料不全患者；并發(fā)其他類型惡性腫瘤患者；接受過放療、化療治療的患者；心腦血管疾病患者；精神疾病患者。所有研究對象及家屬均知情同意，并獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 取所有患者手術(shù)切除癌組織標(biāo)本以及與癌組織距離5 cm以上的癌旁正常胃黏膜組織，使用4%中性福爾馬林對所采集的標(biāo)本進(jìn)行固定，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，之后進(jìn)行連續(xù)切片作免疫組化標(biāo)記以及革蘭染色待用。

1.2.2 免疫組化染色處理 將待測標(biāo)本放在二甲苯中脫蠟處理10 min，將二甲苯更換后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修復(fù)液，在37 ℃的恒溫冰箱中孵化30 min，棄抗原修復(fù)液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的H2O2，去過氧化物酶封閉液，恒溫冰箱孵育10 min，采用PBS淋液沖洗；加入適量的山羊血清，在室溫環(huán)境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS淋液沖洗；經(jīng)過DAB顯色處理10 min，能夠在顯微鏡下觀察到棕黃色陽性反應(yīng)，則采用PBS淋液沖洗1 min；使用蘇木精復(fù)染3 min，然后用濃度為1%的鹽酸乙醇分化處理，自來水沖洗1 min后，脫水并封片處理。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測VPF表達(dá) 將待測的標(biāo)本和酶標(biāo)物嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟與和固相載體產(chǎn)生反應(yīng)作用，將固相載體反應(yīng)的復(fù)合物經(jīng)過洗滌與其他物質(zhì)分離，加入酶反應(yīng)底物，經(jīng)過酶的催化作用形成有色物質(zhì)，根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析VPF的表達(dá)。

1.2.4 熒光定量RT-PCR檢測DCC基因表達(dá) 采用熒光定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說明書進(jìn)行。依次加入2.5 μL的稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2溶液，0.5 μL上游引物和下游引物，最后加水配成總體積為25 μL的反應(yīng)體系。在94 ℃環(huán)境中反應(yīng)1 min；55 ℃環(huán)境中反應(yīng)1 min；72 ℃環(huán)境中反應(yīng)1 min，進(jìn)行35個循環(huán)，72 ℃環(huán)境中反應(yīng)延長5 min，重復(fù)最少3次。采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的DCC基因。

1.2.5 Western blot檢測MMP-9蛋白表達(dá) 將待測標(biāo)本使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，進(jìn)行裂解35 min，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，通過10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V，電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37 ℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4 ℃的環(huán)境下孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復(fù)清洗。最后，加入顯影劑將其在底物溶液中進(jìn)行顯色，嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒操作說明書進(jìn)行，采用目的蛋白條帶分析灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織、癌組織病理組織學(xué)觀察

如圖1所示，癌旁組織細(xì)胞排列較為緊密，大小均勻，形態(tài)一致，細(xì)胞核圓潤，無核分裂現(xiàn)象；胃癌組織細(xì)胞大小不等，排列較為紊亂、疏松、不規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)多樣，多有核分裂現(xiàn)象。

2.2 癌組織與癌旁組織中VPF、DCC及MMP-9表達(dá)對比

如表1所示，癌組織中VPF、MMP-9陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，DCC基因陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1癌組織與癌旁組織中VPF、DCC及MMP-9表達(dá)對比[n(%)]

組別VPFDCCMMP-9癌旁組織(n=50)4(8.00)47(94.00)3(6.00)癌組織(n=50)29(58.00)40(80.00)28(56.00)t值28.274.3329.22P值<0.05<0.05<0.05

2.3 VPF、DCC及MMP-9陽性表達(dá)的相關(guān)性分析

如表2所示，胃癌患者VPF、DCC及MMP-9陽性表達(dá)率與性別、年齡無關(guān)，與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤體積、浸潤程度以及分化程度有關(guān)，Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積較大、侵及漿膜以及分化程度較高的患者VPF、MMP-9陽性表達(dá)率較高，DCC基因陽性表達(dá)率較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 VPF、DCC及MMP-9陽性表達(dá)的相關(guān)性分析[n(%)]

3 討論

胃癌是一種臨床上較為常見的惡性腫瘤，起源于患者胃黏膜上皮，是人體消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤[5]。胃癌發(fā)病率在我國一直居高不下，并且隨著社會發(fā)展，人們生活節(jié)奏不斷加快，飲食不規(guī)律，導(dǎo)致胃癌癥狀發(fā)病率不斷提升，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量及生命安全[6]。

據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，胃癌的主要危險因素包括吸煙飲酒、不健康食品以及胃病史和家族史等，目前診斷胃癌的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)依舊是胃鏡活檢，但是使用該方法檢測出胃癌時，癌細(xì)胞很可能已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。絕大多數(shù)胃癌患者早期無明顯癥狀，這也導(dǎo)致了目前我國胃癌的早期診斷率相對較低，因此如何提高胃癌早期診斷率是目前大多數(shù)學(xué)者主要的研究課題[7-8]。隨著臨床診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，血清指標(biāo)及腫瘤標(biāo)志物檢測逐漸應(yīng)用于胃癌患者的診斷中，臨床中有價值的腫瘤標(biāo)志物有很多，如糖鏈抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)等。但是，這些腫瘤標(biāo)志物在多種惡性腫瘤中均會呈現(xiàn)異常表達(dá)，因此對于胃癌癥狀的臨床檢測特異性較低，診斷效能也不理想[9-10]。

VPF又稱血管內(nèi)皮生長因子[11]，是一種促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有高度的特異性，能提高人體血管的通透性，且能夠一定程度上促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)變性以及血管形成，是近年來臨床上確定的一種具有旁分泌機(jī)制的血管生成因子[12]。VPF作為一種具有較強(qiáng)誘導(dǎo)能力的因子，能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激細(xì)胞的增殖、遷移以及誘導(dǎo)血管的生長，在腫瘤的血管形成過程中起到重要的參與作用，徐鋮等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)血管通透因子在胃癌患者體內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)。VPF是腹膜轉(zhuǎn)移的一種重要的預(yù)測因子，在臨床上較為常見的惡性腫瘤的相關(guān)研究中，均發(fā)現(xiàn)了VPF的較高表達(dá)。李君強(qiáng)等[14]研究提出，如果腫瘤組織大部分出現(xiàn)壞死，產(chǎn)生的VPF腫瘤細(xì)胞會減少；如果出現(xiàn)缺血和缺氧的誘導(dǎo)因素，也不會生成太多的VPF，患者血清中的VEGF水平也會降低。相反情況下，如果大多數(shù)的腫瘤組織處于缺血和缺氧的環(huán)境下，其程度達(dá)不到腫瘤組織壞死的程度時，腫瘤組織會在缺血和缺氧的誘導(dǎo)下生成大量的VPF，患者血清中的VPF濃度也隨之上升。本研究對胃癌患者血清VPF水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，在胃癌癥狀中，血清VPF陽性表達(dá)率較高，說明VPF參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程，與胃癌癥狀的發(fā)展程度具有一定的相關(guān)性。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)是一組內(nèi)肽酶，主要依賴于鋅離子，其中成員分子量大小不同，底物也不完全相同[15]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一種，其作為一種Ⅳ型的膠原蛋白，主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)，還能夠降解明膠、纖維結(jié)合素、彈性蛋白等[16-17]。楊云鵬等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9對Ⅳ膠原蛋白產(chǎn)生破壞，降解細(xì)胞外基質(zhì)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)移到臨近其他健康組織中，為胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究中對胃癌組織中MMP-9表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示在胃癌組織中MMP-9蛋白陽性表達(dá)率較高，說明MMP-9蛋白水平與胃癌癥狀的發(fā)生及發(fā)展有著密切的聯(lián)系，與張靜怡等[19]的研究結(jié)果一致。DCC基因是上個世紀(jì)發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，近年來有許多專家學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)研究證明了DCC基因在結(jié)直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)較低表達(dá)，但是關(guān)于其與胃癌癥狀關(guān)系的報道相對較少。張躍等[20]通過研究表明，DCC基因具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，若人體DCC基因水平出現(xiàn)異常，很有可能會出現(xiàn)細(xì)胞惡變。本文研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，胃癌患者DCC基因水平出現(xiàn)明顯的下降，可能是由于DCC基因出現(xiàn)異常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞惡化，說明DCC基因水平與胃癌發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。

綜上所述，血清VPF、DCC基因及MMP-9蛋白水平在胃癌癥狀中呈現(xiàn)異常表達(dá)，且具有一定相關(guān)性，為胃癌的臨床診斷提供一定的價值幫助。