血漿循環(huán)腫瘤DNA與宮頸癌臨床病理、療效及預(yù)后的關(guān)系

廖麗川，孟以秀，向安玲，趙昌芹

(重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院婦科，重慶 405400)

宮頸癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的婦科惡性腫瘤之一，有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率基本維持在334/10萬～555 /10萬人左右[1]。在我國，每年新發(fā)病例約10萬，占全世界新發(fā)病例總數(shù)的1/5，且近年有明顯上升趨勢(shì)，多呈年輕化，給女性生活和生命健康帶來極大威脅[2]。宮頸癌篩查是其主要診斷途徑，主要包括高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)、宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)、陰道鏡檢查及宮頸組織活檢等，但仍有部分患者覺得以上檢查繁瑣且有一定不舒適感而拒絕[3]。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一種因?qū)嶓w腫瘤細(xì)胞凋亡或破裂而釋放進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)的基因片段，主要存在于血液、腦脊液及滑膜液等液體中，具有與原發(fā)腫瘤組織一致的特性，提示了其在腫瘤診療中的價(jià)值[4-5]。近年，有研究發(fā)現(xiàn)ctDNA可真實(shí)體現(xiàn)不同治療手段下早期或晚期非小細(xì)胞肺癌腫瘤負(fù)荷變化，突出了其在惡性腫瘤診療中價(jià)值[6]。但關(guān)于其與宮頸癌臨床病理、療效及預(yù)后的關(guān)系的研究少見，具有一定探討價(jià)值。本文研究ctDNA在宮頸癌和正常女性中的差異，并探討其與宮頸癌臨床病理、療效及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年1月于重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院診治的188例宮頸癌患者作為研究對(duì)象，命名為宮頸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《婦產(chǎn)科學(xué)·八年制·第二版》[7]中宮頸癌診斷者；(2)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期[8]在I-III期者；(3)首次診斷者；(4)均接受手術(shù)或同步放化療治療者，且臨床資料完整者；排除診斷：(1)合并其它原發(fā)惡性腫瘤者；(2)入組前接受任何治療者；(3)有精神病史或家族史者。同時(shí)選取同期于本院體檢的200例健康女性為健康對(duì)照組。本研究所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，并通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。宮頸癌組：年齡(49.16±6.35)歲；體重指數(shù)(BMI)(24.96±2.35)kg/m2；健康對(duì)照組：年齡(49.31±6.54)歲；BMI(24.42±2.12)kg/m2。兩組在年齡及BMI等一般資料上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 抽取宮頸癌組治療前后和健康對(duì)照組5 mL空腹靜脈血于EDTA抗凝管中，充分混勻，2 h內(nèi)以4 000 r/min 離心5 min分離血漿，并將其保存于-80 ℃冰箱中待集齊檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法 主要分為兩步：第一，采用兩步磁珠法(北京臻和科技有限公司)提取血漿游離DNA， 具體參照操作說明書：準(zhǔn)備一個(gè)干凈離心管，并向其中分別加入100 μL血漿、10 μL蛋白酶K、185 μL緩沖液、15 μL異丙醇和20 μL磁珠，漩渦振蕩，使其充分均勻以得到磁性分離，后將上清液移至新離心管，即得到純化游離DNA；第二，采用Nanodrops 2000分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)檢測(cè)游離DNA含量。采用受試工作者曲線(ROC)確定ctDNA高低表達(dá)臨界值：以ctDNA含量≥14.64為高表達(dá)(102例)；以ctDNA含量<14.64為低表達(dá)(86例)。

1.3 隨訪

本研究對(duì)宮頸癌組患者隨訪3年，收集患者3年無進(jìn)展生存(progression free survival，PFS)和3年總生存(overall survival，OS)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組ctDNA含量比較

宮頸癌組ctDNA含量為(15.76±3.18)ng/mL，高于健康對(duì)照組(7.82±1.63)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.218，P=0.001)。

2.2 ctDNA與宮頸癌臨床病理的關(guān)系

ctDNA含量在組織學(xué)分級(jí)、浸潤間質(zhì)深度、淋巴轉(zhuǎn)移及FIGO分期上差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以高分化、浸潤間質(zhì)深度≥1/2、存在淋巴轉(zhuǎn)移及FIGO III期者為ctDNA高表達(dá)者居多，反之則為低表達(dá)者；但在年齡、腫瘤大小和是否累積子宮下段上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 ctDNA與宮頸癌臨床病理的關(guān)系(%)

2.3 ctDNA與宮頸癌治療的關(guān)系

治療前宮頸癌 ctDNA含量為(15.76±3.18)ng/mL，治療后ctDNA含量(10.37±2.69)ng/mL，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 ctDNA與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

隨訪3年，與高表達(dá)者比較，低表達(dá)者DFS生存率和OS生存率明顯增高(44.12%vs.62.79%；47.06%vs.67.44%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.526,P=0.011；χ2=7.883，P=0.005)。見圖1。

2.5 影響宮頸癌預(yù)后的多因素COX回歸分析

經(jīng)多因素COX回歸分析得知，有淋巴轉(zhuǎn)移、FIGO III期和ctDNA高表達(dá)是影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響宮頸癌預(yù)后的多因素COX回歸分析

賦值：組織學(xué)分級(jí)(中低分化=1；高分化=0)、浸潤間質(zhì)深度(≥1/2=1；<1/2=0)、淋巴轉(zhuǎn)移(是=1；否=0)、FIGO分期(I=1；II=2；III=3)、ctDNA含量(高表達(dá)=1；地表達(dá)=0)。

3 討論

近年，我國醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步迅速，宮頸癌診療技術(shù)提高是其重要體現(xiàn)之一，但其死亡率仍居高不下[9]。究其原因，大部分學(xué)者認(rèn)為這與腫瘤異質(zhì)性有關(guān)，這是在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞歷經(jīng)數(shù)次分裂和增殖后，其子代在基因組、蛋白組及表觀遺傳學(xué)上發(fā)生變化，最終造成其在增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、治療及預(yù)后上各具差異[10-11]。目前關(guān)于腫瘤異質(zhì)性的檢測(cè)主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)、播散腫瘤細(xì)胞(disseminated tumor cell,DTC)及ctDNA等，為患者精準(zhǔn)治療打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[12]。近年ctDNA研究火熱，研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA核酸序列與腫瘤組織樣本來源腫瘤特異性核酸序列高度一致[13]；而ctDNA在不同癌癥類型和同一癌癥類型不同個(gè)體之間差異較大，在同一個(gè)體中，可隨“腫瘤負(fù)荷情況”及疾病嚴(yán)重程度變化，高濃度ctDNA即預(yù)示著惡性程度高、腫瘤晚期或不良預(yù)后[14-15]。

在本研究中，通過對(duì)比分析188例宮頸癌患者和200例健康體檢女性血漿ctDNA含量發(fā)現(xiàn)宮頸癌血漿ctDNA含量明顯高于健康人群，與國內(nèi)外主流意見基本一致[16-17]，提示血漿ctDNA檢測(cè)對(duì)宮頸癌診斷可能具有一定價(jià)值。此后，本研究還探討了血漿ctDNA與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其在高分化、浸潤間質(zhì)深度≥1/2、存在淋巴轉(zhuǎn)移及FIGO III期患者中為ctDNA高表達(dá)者(P<0.05)，而在不同年齡、腫瘤大小及是否累積子宮下段上差異不明顯(P>0.05)，提示其可作為臨床病理特征的參考指標(biāo)，為手術(shù)醫(yī)師術(shù)前評(píng)估腫瘤情況提供依據(jù)。此外，本研究還探討了血漿ctDNA與宮頸癌治療療效及預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與治療前比較，治療后宮頸癌患者血漿ctDNA含量明顯降低(P<0.05)，說明其對(duì)患者治療療效評(píng)估可能有一定參考價(jià)值，這是因?yàn)閏tDNA含量在一定程度上可提示腫瘤負(fù)荷變化，從而反映治療效果。隨訪3年，與血漿ctDNA高表達(dá)者比較，低表達(dá)者DFS生存率和OS生存率明顯增高(P<0.05)，提示血漿ctDNA與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)。眾多研究表明，治療前ctDNA是影響腫瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，以非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌及卵巢癌等中較為多見[18]，但在宮頸癌預(yù)后中的評(píng)估價(jià)值尚不明確。本研究前述提示ctDNA與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)，具體價(jià)值尚不明確，為此本研究進(jìn)行了預(yù)后影響因素的多因素COX回歸分析，發(fā)現(xiàn)有淋巴轉(zhuǎn)移、FIGO III期和ctDNA高表達(dá)是影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，前面兩者是臨床較為成熟的結(jié)論，而后者則為宮頸癌預(yù)后評(píng)估提供了新的方向，為提高預(yù)后評(píng)估準(zhǔn)確率作出了貢獻(xiàn)。

綜上認(rèn)為，宮頸癌患者中血漿ctDNA含量較高，在不同組織學(xué)分級(jí)、浸潤間質(zhì)深度、淋巴轉(zhuǎn)移及FIGO分期等臨床病理特征上差異明顯，與治療及預(yù)后相關(guān)，有望成為宮頸癌臨床診療及預(yù)后檢測(cè)的有效指標(biāo)。但至今為止，血漿ctDNA檢測(cè)技術(shù)仍是影響臨床推廣的重要原因，提高檢驗(yàn)技術(shù)是后續(xù)研究的重點(diǎn)之一。