MTHFR基因多態性與深靜脈血栓形成及血瘀積分的相關性分析

駱珍玉23方主亭王 沆丁 航駱杰偉

深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)形成指深靜脈血液出現異常凝聚致使靜脈內血液不能正常回流的一系列疾病，常導致血栓后綜合征(PTS)，病情嚴重者影響生活質量，甚至導致死亡。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)發生變異，引起血同型半胱氨酸(Hcy)代謝通路發生障礙，Hcy堆積，產生一系列心腦血管病理改變，是以MTHFR基因錯義突變作為誘發相關心腦血管疾病的諸多可能因素之一[1]，DVT基因檢測的個體化與中醫證候的多樣性及繁復性一致，部分靶向基因檢測已逐漸應用于臨床，但基因多態性與中醫證候的相關性研究處于初級階段。本研究前瞻性分析福建地區MTHFR基因多態性、DVT形成及Hcy之間關系，并探討其多態性及血Hcy水平與血瘀證候表型的關系，為DVT形成機制及防治提供思路與理論依據。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 DVT診斷標準：參照2012年DVT的診斷和治療指南[2]；中醫血瘀證診斷標準：參照2016年實用血瘀證診斷標準[3]制定。

1.2 納入標準 DVT組：符合診斷DVT診斷標準，根據中醫血瘀證診斷標準診斷為血瘀證，研究對象之間不存在血緣關系，且長期居住于福建省，研究對象知情同意，并簽署相關知情同意書。對照組：體格檢查、心電圖(ECG)、血常規、凝血系列、肝腎功能等臨床生化指標及中醫望、聞、問、切四診均無明顯異常體檢者，且研究對象之間不存在血緣關系，長期居住于福建省，研究對象知情同意，簽署相關知情同意書。

1.3 排除標準 DVT組：嚴重或惡性貧血、血小板增多癥及抗磷脂綜合征、原發性腎臟疾病、動靜脈瘺、自身免疫相關性疾病等全身其他組織器官或系統性重大疾病；嚴重急性感染；孕產期及口服避孕藥女性；根據中醫血瘀證診斷標準診斷為非血瘀證；不能配合信息采集或精神病病人。對照組：根據中醫血瘀證診斷標準診斷為血瘀證；孕產期及口服避孕藥者；不能配合信息采集或精神病病人。

1.4 一般資料 符合醫學倫理學基本原則，收集2016年1月—2017年1月在福建省立醫院就診并且符合相關納入和排除標準的DVT病人168例，男92例，女76例；年齡(60.58±13.30)歲；評價DVT病人血瘀證候積分，按血瘀程度分組，輕度血瘀證85例，中度血瘀證73例，重度血瘀證10例。同期收集福建省立醫院健康體檢者159名作為對照組，男78名，女81名，年齡(59.38±13.26)歲。

1.5 相關指標及方法 以問診形式收集臨床基線資料，采用統一規范的血瘀證診斷標準信息采集表，按照中醫傳統四診方法予以采集病情資料，并做好記錄。雙試劑循環酶法檢測血漿Hcy水平。根據北京天根血液基因組DNA提取試劑盒提取方法進行基因組DNA提取，Primer5.0 Input軟件自行設計MTHFR基因引物，進行MTHFR基因聚合酶鏈反應(PCR)，直接檢測法檢測MTHFR基因型。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 DVT組與對照組血Hcy水平比較，差異有統計學意義(P=0.003)，并對DVT組病人進行血瘀積分計分，結果血瘀積分值為14.00(6.00，20.00)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 基因測序圖 MTHFR存在(ttgaaggagaaggtgtctgcgggag[c/t]cgatttcatcatcacgcagcttttc)C677T多態性，677C→T，導致堿基編碼的丙氨酸(Ala)被替換為纈氨酸(Val)，改變相關蛋白質結構，進而改變MTHFR活性。MTHFR基因經測序得到CC、CT、TT 3種基因類型，分別為圖A、B、C，箭頭指向為位點突變位置堿基。詳見圖1。

圖1 MTHFR C677T基因型的測序圖

2.3 MTHFR基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 兩組MTHFR基因進行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗，MTHFR基因的基因型分布頻率預計值及觀測值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，與Hardy-Weinberg遺傳平衡定律相符合(DVT組χ2=0.980，P=0.320；對照組χ2=0.003，P=0.960)。說明本研究人群達到遺傳平衡，具有一定的群體代表性。詳見表2。

表2 MTHFR基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 例(%)

2.4 DVT組與對照組MTHFR C677T基因多態性基因型比較 兩組MTHFR基因型總分布頻率比較，差異有統計學意義(χ2=9.694，P=0.008)，進一步χ2分割檢驗提示：DVT組CT+TT頻率(44.05%)高于對照組的(29.56%)，差異有統計學意義(χ2=7.355，P=0.007)。

2.5 DVT組不同MTHFR基因類型血Hcy水平比較 不同基因類型Hcy比較，差異有統計學意義(χ2=14.478，P=0.001)；再進一步對不同基因類型之間Hcy進行兩兩比較，結果顯示：DVT組MTHFR基因CC型與CT型、CC型與TT型、CT型與TT型Hcy比較，差異均有統計學意義(Z=-2.374，P=0.018；Z=-3.367，P=0.001；Z=-2.219，P=0.026)。詳見表3。

2.6 DVT組MTHFR基因CC型與CT+TT型血瘀程度比較 DVT組MTHFR基因CC型與CT+TT型不同血瘀程度人數構成比不同，含等位基因T的中度、重度血瘀證人數構成比高于CC型，差異有統計學意義(χ2=7.792，P=0.020)。詳見表4。

表3 DVT組不同MTHFR基因類型血Hcy水平比較 μmol/L

表4 DVT組MTHFR基因CC型與CT+TT型血瘀程度比較 例(%)

2.7 DVT組不同血瘀程度分級與血Hcy水平比較 DVT組輕度血瘀證85例，中度血瘀證73例，重度血瘀證10例，因重度血瘀證病人僅10例，病例數較少，數據統計易發生偏移，故與中度血瘀證合并為一類進行相關數據分析。輕度血瘀證血Hcy水平低于中度+重度血瘀證，差異有統計學意義(Z=-3.571，P<0.001)。詳見表5。

表5 DVT組不同血瘀程度分級與血Hcy水平比較 μmol/L

注：Z=-3.571，P<0.001

2.8 DVT組血瘀積分與血Hcy水平相關性分析 應用Pearson相關分析及偏相關分析DVT組Hcy水平與血瘀證候積分的相關性，將年齡作為控制條件。未控制年齡的影響，血瘀證候積分與血Hcy水平呈正相關(r=0.256，P=0.001)；控制年齡影響因素后，血瘀證候積分與血Hcy水平呈正相關(r=0.264，P=0.001)。提示血瘀證候積分與血Hcy水平之間存在呈正相關。

2.9 DVT病人的多因素二項Logistic回歸分析 對DVT病人的多因素二項Logistic回歸分析，二項為DVT組與對照組兩個組別，以對照組為參照，以是否患有DVT為因變量(DVT組=1，對照組=0)，以MTHFR-CC/CT+TT型、Hcy、性別、體質指數、年齡、飲酒、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥、癌癥、手術史及靜脈曲張為自變量，MTHFR-CC/CT+TT型、Hcy、高血壓、癌癥、靜脈曲張為DVT的危險因素(P<0.05)。調整混雜因素后，MTHFR-CC/CT+TT型的相對危險度(OR=1.798，95%CI：1.082～2.988，P=0.024)，Hcy的相對危險度(OR=1.059，95%CI：1.004～1.118，P=0.036)。詳見表6。

表6 DVT病人的多因素二項Logistic回歸分析

3 討 論

MTHFR是Hcy代謝過程中一種關鍵的限速酶，Goyette等[4]首次克隆出人的MTHFR cDNA，MTHFR基因位于1 p36.3染色體區，編碼區長度1.98 kb，cDNA長度為2.2 kb，11個外顯子在102～432 bp，10個內含子在250～1 500 bp。該基因常存在遺傳變異與基因多態性，目前發現的突變位點有20多個，其中MTHFR基因C677T突變較常見，Frosst等[5]最先發現該突變位點，MTHFR基因的第677個核苷酸位點上，堿基胞嘧啶C被堿基胸腺嘧啶T替換，使其編碼的高度保守氨基酸丙氨酸(Ala)被替換成為纈氨酸(Val)，降低黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和MTHFR的結合能力，進而降低MTHFR酶的活性與熱穩定性，雜合突變MTHFR酶活性下降至71%，純合突變MTHFR酶活性只有約34%。本研究提示攜帶有MTHFR基因CT/TT基因型及高Hcy是DVT形成的危險因素，且可能是DVT血瘀證形成的易感因素之一，與相關報道[6-7]相符，其機制可能是：MTHFR基因缺陷引起多個基礎生化過程發生紊亂，進而產生諸多心血管病證，其中MTHFR基因C677T突變引起DVT機制復雜，其基因突變導致的高Hcy與血栓形成關系密切，高Hcy損傷血管內皮及平滑肌細胞，破壞內皮功能及完整性，血小板在血管腔內聚集率增加，誘發相關血管的粥樣硬化及血栓形成[8]。Qian等[9]發現MTHFR C677T與動脈粥樣硬化之間存在明顯相關性，高Hcy致使脂質代謝紊亂，加速氧化，損傷血管內皮，血管壁增厚促使血管狹窄。Hcy呈濃度依賴性促進細胞內活性氧的產生，抑制超氧化物歧化酶及谷胱甘肽水平，使抗氧化物的活性降低，導致氧化應激。進一步抑制精氨酸轉運，導致L-精氨酸缺乏，使一氧化氮(NO)形成減少，還可能產生內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的解偶聯[10]。同時誘導基質金屬蛋白酶2(MMP-2)表達，增加細胞內鈣離子濃度，與血管平滑肌鈣化相關[11]。NO是內皮細胞分泌的舒張血管物質，NO活性降低不僅損傷血管內皮，而且激活相關炎癥因子，加重血管病變，MTHFR基因TT型NO水平下降與CC/TT型有顯著差異[12]，進一步推測MTHFR基因C677T突變通過內皮損傷、脂質代謝紊亂、激活部分凝血因子、降低NO水平等途徑導致血栓形成，但均與其突變導致的高Hcy密切相關。邱玲等[13]發現MTHFR基因C667T多態性與DVT形成無關，但Hcy水平提高是DVT發病的獨立危險因子。Morelli等[14]研究亦顯示MTHFR基因C677T多態性TT型并未增加患DVT風險。各家報道結論不一可能與該基因突變存在種族與地域性差異相關。

血瘀證是多種疾病如冠心病、高血壓、腦梗死、栓塞證等的共有證候，是一個具有共同特性的基礎證，具有整體性、概括性及預測性，是證候本質研究的一個最具代表性證候。從腎為先天之本，主液，主納氣，為氣之根，氣能行血等方面，可知血瘀易感性與先天遺傳因素存在一定聯系。中醫較早認識到體質的差異性與疾病的易感性及個體對藥物治療反應的多樣性相關，同一種疾病常表現出不同的證候，而不同疾病可有相同證候，可見同一種疾病的不同證候除了基因表達的差異外，可能存在多種基因的多態性，同一證候亦可能存在多種基因的多態性，提示證候是由多種基因共同參與調控的，且處于人體正常網絡調節能力之上的“絡病”證候群。這些證候群之間的維系是通過由各自癥狀的相關表達基因構成的一個調節網絡實現，調節網絡中各個基因作用不同，這種差別既是區別其他證候的物質基礎，也是認同其所代表的典型表現在證候中的關鍵性與貢獻度的證據[15]。中醫證候作為中醫藥理論基石，是中醫藥理論的特色與優勢所在，大力發展中醫證候研究將是中醫藥現代化與國際化的切入點，血瘀證為代表性證候。隨著現代分子生物學、基因組學的不斷研究，為客觀地實施臨床證候表型(分型)研究提供有利條件，有效推動中醫基礎理論與臨床診療的發展。本研究從遺傳學領域的基因多態性入手，初探MTHFR基因多態性與血瘀證的相關性，提示MTHFR基因突變CT/TT型可能是DVT血瘀證的易感因素之一，同時提示高Hcy可能與血瘀證形成相關，能否作為血瘀證的一個診斷指標有待進一步研究。

綜上所述，治療DVT以改善病人生活質量，降低致殘率、死亡率為最終目的。近年來MTHFR基因多態性研究較多，尤其是MTHFR C677T多態性，其與多種疾病均存在相關性，可能與遺傳、人種及地域相關，本研究發現攜帶MTHFR基因677 CT/TT基因型及高Hcy是DVT形成的危險因素。在中醫基礎理論指導下，運用精準醫學技術和方法，結合中醫望、聞、問、切四診所得信息，實現精準的中醫辨證分類及診療，是中醫藥發展的方向。本研究結果顯示MTHFR基因677 CT/TT基因型可能是DVT血瘀證形成的易感因素之一，為基因多態性與中醫血瘀證的相關性提供了客觀依據。