鹿紅方對氧糖剝奪模型心臟干細胞自噬和抗凋亡能力的影響

心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)移植治療缺血性心肌病具有廣闊的應用前景，但移植細胞的高凋亡率是影響干細胞療法療效的重要原因。如何提高干細胞在缺血、缺氧環境的生存率成為目前研究的熱點。干細胞領域相關研究顯示，在多種應激狀態下，適當自噬可提高干細胞抗凋亡能力[1-3]。多種化學物質通過改善應激狀態下干細胞自噬，可提高細胞抗凋亡能力[4]。本研究探討中藥復方鹿紅方(LHF)對氧糖剝奪模型CSCs自噬和CSCs抗凋亡能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 CSCs及實驗藥物 CSCs購自Lonza公司；鹿紅方由上海中醫藥大學附屬曙光醫院制劑室提供，由鹿角片、紅花、仙靈脾、補骨脂、女貞子、山萸肉、沉香按15∶9∶30∶20∶15∶30∶6 比例配制。鹿紅方水提物制備方法如下：將藥材置不銹鋼鍋中，加適量水浸泡1 h，置于電磁爐上，先用大火煮沸后，再用小火保持微沸煎煮1 h，18層紗布過濾，濾液備用；另外再加適量水同法再煎煮1次，18層紗布濾過，合并兩次藥液，于60 ℃旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，在60 ℃真空干燥，干膏稱重，再碾為均勻細粉，備用。

1.1.2 主要實驗試劑 DMEM/F12培養基、IMDM培養基、胎牛血清、無血清培養基均購自美國GIBCO公司；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自上海易色公司；自噬抑制劑3-MA購自美國Sigma公司；GAPDH抗體購自天津三箭公司；Beclin-1、LC3-Ⅱ兔抗購自英國Abcam公司。

1.1.3 主要實驗儀器 三氣培養箱購自日本松下公司；水浴恒溫搖床購自上海漢諾公司；CO2細胞培養箱購自美國Thermo公司；超凈臺，購自美國BioX公司；多功能酶標儀T0-3型購自瑞士Tecan公司；-80 ℃冰箱購自日本Sanyo公司。

1.2 CSCs氧糖剝奪模型制備 氧糖剝奪模型制備參考Wohnsland 等[5]報道方法并加以改進，簡述如下：取1 mL凍存CSCs(1～10)×107，常規復蘇后轉移至無血清培養基，并置于37 ℃三氣培養箱中，設置氣體比例：N2∶CO2為95%∶5%。將此混合氣體以流速10 L/min通過三氣培養箱，至測氧儀檢測箱中氧氣體積分數為3%時停止通氣。氧糖剝奪持續時間為1.5 h。

1.4 實驗分組及干預方式 將CSCs隨機分為對照組(正常培養)與氧糖剝奪造模組(缺血缺氧)。將造模組分為模型組(不予有效干預措施)、3-MA組(給予自噬阻斷劑)、LHF200組(給予LHF 200 μg/mL)和LHF200+3-MA組(給予LHF 200 μg/mL+自噬阻斷劑)。3-MA為自噬抑制劑，用于阻斷自噬過程。各組干預方式見表1。

表1 實驗分組及造模和干預方式

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 光鏡及CCK-8法檢測CSCs活細胞數量 首先光鏡下觀察各組CSCs形態，之后將待測CSCs細胞懸液接種于96孔培養板中(104細胞/孔)。加入CCK-8試劑10 μL，混勻后37 ℃，5%CO2培養箱孵育1.5 h，測定450 nm處OD值。酶標儀讀取待測樣品和空白參照在450 nm處OD值。將各待測樣本OD值記為測量值，空白參照OD值作為空白值，終值=測量值-空白值；通過判定OD值反映活細胞數量。

1.5.2 Western Blot檢測CSCs自噬相關蛋白的表達 采用Western blot法測定各組CSCs表達自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，測定方法按照相關研究[7]進行，具體如下：蛋白用SDS-PAGE提取分離，然后轉膜至聚乙烯二氟膜上。孵育一抗，稀釋比如下：Beclin-2 1∶1 000；LC3-Ⅱ為 1∶100；過夜，室溫下孵育二抗1 h。最后采用灰度值半定量法分析蛋白表達量。

1.5.3 RT-PCR檢測CSCs自噬相關蛋白基因的表達 應用RT-PCR法檢測Beclin-1及LC3-Ⅱ基因表達。操作根據說明書進行，按照相關研究[7]進行，具體如下：應用TRIzol法提取總RNA。用TRIzol RNA提取劑(Invitrogen)提取核酸蛋白復核物，核酸蛋白復合物經氯仿抽取、異丙醇中沉淀，75%乙醇清洗及RNase-free水中純化后離心。將GAPDH表達水平作為內控，以iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif)反轉錄總RNA。用XX amplification；根據目的基因序列信息設計并合成PCR檢測引物，序列見下表2。PCR條件如下：預變性95 ℃ 2 min，1個循環，60 ℃下退火20 s，之后72 ℃下延伸20 s，樣本共進行40次循環，SYBR Green法熒光定量PCR分析各基因表達，最后使用2-△△Ct法進行各基因表達的相對定量。

表2 RT-PCR檢測引物序列

2 結 果

2.1 光鏡下各組CSCs形態觀察 正常組可見細胞數目較多，形態呈較規則梭形，懸浮細胞少；模型組可見細胞數量較少，大部分細胞皺縮，懸浮細胞較多，提示大量細胞凋亡壞死；3-MA組與模型組接近；LHF200組與模型組及3-MA組比較，細胞密度上升，形態相對穩定，皺縮細胞少，懸浮的凋亡細胞數較少，提示凋亡細胞減少；LHF200+3-MA組可見細胞凋亡較LHF200組增加。詳見圖1。

1為正常組；2為模型組；3為3-MA組；4為LHF200組；5為LHF200+3-MA組

2.2 CCK-8檢測各組CSCs活細胞OD值 對照組與各造模組CSCs活細胞OD值比較，差異有統計學意義(P<0.001)，各造模組CSCs活細胞OD值顯著降低，表明在氧糖剝奪模型下，細胞發生大量凋亡； LH200F組和模型組比較，CSCs活細胞OD值顯著增高，差異有統計學意義(P<0.001)，提示鹿紅方可減少缺血缺氧狀態下CSCs凋亡；LHF200+3-MA組與LHF200組比較，CSCs活細胞OD值下降，差異有統計學意義(P=0.03)。詳見表3。

表3 CCK-8檢測各組CSCs活細胞OD值(±s)

與對照組比較，1)P<0.001；與模型組比較，2)P<

0.01；與LHF 200組比較，3)P<0.05

2.3 Western Blot蛋白檢測 模型組與對照組比較，Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達顯著升高(P<0.001)，表明氧糖剝奪模型可促進CSCs自噬關鍵蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表達；3-MA組與模型組比較，Beclin-1和LC3-Ⅱ表達顯著降低(P<0.001)；LHF200組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達與模型組比較顯著降低(P<0.001)，顯著高于3-MA組和LHF200+3-MA組(P<0.001)。詳見圖2、圖3。

與對照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與3-MA組比較，△P<0.001

圖2各組Beclin-1蛋白表達比較

與對照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與3-MA組比較，△P<0.001

圖3各組LC3-Ⅱ蛋白表達比較

2.4 RT-PCR基因表達檢測 與對照組比較，模型組Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達顯著升高(P<0.001)，表明氧糖剝奪模型可促進CSCs自噬的發生，這與Western Blot檢測蛋白表達結果一致；與模型組比較，3-MA組Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達顯著降低(P<0.001)，提示3-MA可阻斷自噬；LHF200組與模型組比較，Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達顯著降低(P<0.001)，提示LHF可調節CSCs缺血、缺氧應激條件下自噬，防止過度自噬，這與Western Blot檢測蛋白表達結果一致。詳見圖4、圖5。

與對照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001

與對照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001

3 討 論

自噬是細胞利用溶酶體降解自身過多或有功能缺陷的細胞內成分，從而維持細胞能量水平，更新胞質成分的過程[8]。根據細胞物質運送溶酶體途徑不同，分為3種自噬：大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬[9-10]。其中大自噬是主要的自噬形式(本研究提到的“自噬”均指大自噬)，在生理狀態下，機體存在一種程度較低的基礎狀態自噬，這種狀態通過降解損壞的細胞器和無用蛋白質起到調控細胞存活、維持機體穩態的作用[11]。在病理狀態下，面對各種應激，自噬對細胞存亡影響有兩種不同的觀點：一種認為自噬的啟動是細胞凋亡的前奏，主要起到加速細胞凋亡的作用[10]；另一種認為，自噬是應對外界刺激的保護性行為，及時清除部分壞死組織和不良代謝產物，從而為總體細胞存活提供機會[11]。相關實驗研究提示，自噬的啟動和發生程度與不同的應激類型、持續時間和細胞種類相關[12]。應激狀態下，一定程度的自噬，通過清掃損壞細胞器、循環利用細胞內營養及消化聚集蛋白，從而阻止或減弱內質網反應、DNA損傷和能量耗竭等導致細胞凋亡的發生[13]。

干細胞領域相關研究顯示，在多種應激下，自噬能提高干細胞抗凋亡能力[1-3]：骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)存在較高的基礎自噬狀態，應用無血清環境誘導BM-MSCs可增強自噬，結果提示蛋白Bcl-2和Bcl-xL能刺激自噬體生成，促進保護性自噬的發生，增強營養缺乏應激下BM-MSCs存活能力；阿托伐他汀可激活自噬，從而減少低氧無血清應激下BM-MSCs死亡，并應用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導劑rapamycin驗證自噬與抗細胞凋亡之間的關系；自噬的增強對降低氧化應激下BM-MSCs死亡率起重要作用?？梢娺m當的自噬有利于提高BM-MSCs的存活率，而其是否亦能對CSCs的存活率產生影響，國內外相關報道較少。

本研究結果顯示，與對照組相比，模型組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白和mRNA表達顯著增加，提示缺血缺氧環境刺激細胞啟動自噬；LHF200組自噬蛋白和其基因表達顯著高于3-MA組，低于模型組，免疫熒光結果與之一致，LHF200組細胞凋亡程度最低。提示LHF通過調節自噬降低缺血缺氧環境下CSCs凋亡率。

現代中醫認為，自噬現象符合中醫正邪相爭理論，自噬是對機體正虛邪實做出的一種自我調節方式[14]；細胞自噬與機體臟腑功能低下，內生痰濁、瘀血之實邪的自我清除以維持內環境的陰陽平衡及中醫氣虛情況下通過“精化氣”，維持機體生命活動機制一致[15]。LHF以補腎活血法為治療大法，由鹿角片、紅花、補骨脂、淫羊藿、山萸肉、女貞子和沉香組成。方中鹿角片溫補肝腎、補益精血，使腎氣有根，自然上通于心，紅花活血化瘀通經兼涼血解毒，共為君藥；補骨脂補腎助陽、納氣平喘，淫羊藿溫腎壯陽，二藥共同協助鹿角溫補腎陽，均為臣藥；山萸肉補益肝腎、收斂固澀，女貞子補益肝腎之陰，在方中含“陰中求陽”之意，沉香溫腎納氣、降逆平喘，三藥共為佐使藥。諸藥合用，共奏補腎活血之功效。有研究發現，補腎活血類方劑具有抑制卵巢顆粒細胞過度自噬作用[16]；活血類方劑通過調節自噬活性，保護心肌細胞缺血損傷[17]。

綜上所述，補腎活血的LHF通過調節腎之真陰真陽平衡，從而調節五臟陰陽，通過活血理氣，增強CSCs抗凋亡能力。由于LHF調節細胞自噬的具體機制復雜，尚有較多問題如自噬程度的調控機制，適當自噬的標準等是今后深入研究的內容。