銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

銀杏內(nèi)酯是銀杏葉的主要活性成分，其中以銀杏內(nèi)酯B活性最高，秦兵等[1-3]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B通過抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而對(duì)腦組織、肝臟缺血再灌注損傷起到一定抑制作用。本研究探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～260 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(冀)2013-1-003]，合格證號(hào)：201704002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 銀杏內(nèi)酯B購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：33570)；末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)：161008)；凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3)多克隆抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：201612013、201608010、201707009)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將100只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(0.9%氯化鈉溶液)、模型組(0.9%氯化鈉溶液)及銀杏內(nèi)酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組20只。其中銀杏內(nèi)酯B中劑量(30 mg/kg)組根據(jù)人給藥劑量換算而來，另設(shè)低劑量組(15 mg/kg)和高劑量組(60 mg/kg)。模型制備[4]：腹腔注射1.2%烏拉坦實(shí)施麻醉后，連接心電圖進(jìn)行心電監(jiān)測(cè)，取仰臥位、剝離氣管并插管、連接動(dòng)物呼吸機(jī)，開胸并剝離左冠狀動(dòng)脈，夾閉前降支，心電圖示ST段抬高或T波高聳為心肌缺血；30 min后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)冠狀動(dòng)脈前降支血流灌注，ST段或T波恢復(fù)提示心肌再灌注成功。除不夾閉血管外，假手術(shù)組操作同模型組。各組每日1次腹腔注射給予相應(yīng)濃度藥物，模型組和假手術(shù)組給予0.9%氯化鈉溶液，療程7 d。

1.3.2 心肌梗死體積計(jì)算 各組隨機(jī)取6只大鼠，麻醉后開胸取心臟組織，置-20 ℃冰箱凍存0.5 h，之后進(jìn)行心臟組織切片，取厚度2 mm，浸入37 ℃恒溫濃度1%的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液，避光孵育0.5 h，每5 min翻動(dòng)切片一次使之均勻著色。染色后灰白色為心肌梗死區(qū)，紅色為正常組織，拍照后應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算心肌梗死體積。

1.3.3 蘇木精-伊紅(HE)染色法進(jìn)行心肌組織病理學(xué)檢查及TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡 各組隨機(jī)取6只大鼠，取心臟組織后置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，之后經(jīng)切片、脫蠟、HE染色、脫水、封片等處理后，通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。取石蠟切片，按照TUENL試劑盒方法步驟處理后，通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌細(xì)胞凋亡狀態(tài)，顯微鏡下計(jì)算視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，每張切片隨機(jī)取5個(gè)不重疊的視野，分別取細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)平均值，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)：AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.4 免疫蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 取各組剩余8只大鼠，麻醉后開胸取心臟并剪取心室部位，剪碎后加入9倍量蛋白裂解液，冰水浴中研磨勻漿，低溫(4 ℃)12 000 r/min離心15 min處理，蛋白質(zhì)定量(BCA)法行蛋白定量后實(shí)施高溫蛋白變性，電泳。待溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)停止、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3、β-actin(1∶500)4 ℃過夜；洗膜，二抗(1∶100)室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心電監(jiān)測(cè)結(jié)果 除假手術(shù)組外，其余各組大鼠造模過程，夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支后左心室前壁呈灰白而后逐漸呈現(xiàn)發(fā)紺癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，30 min后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)前降支血流，提示造模成功。與模型組比較，經(jīng)銀杏內(nèi)酯B治療7 d后，缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形明顯改善，其中銀杏內(nèi)酯B高劑量組心電波形基本恢復(fù)正常。詳見圖1。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為銀杏內(nèi)酯B低劑量組；D為銀杏內(nèi)酯B中劑量組；E為銀杏內(nèi)酯B高劑量組

圖1各組大鼠心電圖

2.2 各組大鼠心肌梗死體積比較 模型組大鼠心肌組織梗死體積較假手術(shù)組顯著升高(44.8±5.9)%與(0.0±0.0)%，P<0.01；銀杏內(nèi)酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組梗死體積分別為(40.1±7.3)%、(31.7±6.0)%、(22.3±4.5)%，與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B中劑量組、高劑量組心肌梗死體積顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織肌原纖維斷裂，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，胞漿著色不均，胞核固縮、深染、界限不清等病理性改變；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組上述病理性改變呈不同程度改善，以銀杏內(nèi)酯B高劑量組效果最顯著。詳見圖2。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為銀杏內(nèi)酯B低劑量組；D為銀杏內(nèi)酯B中劑量組；E為銀杏內(nèi)酯B高劑量組

圖2各組大鼠心肌組織形態(tài)(HE，×200)

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況 與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，以高劑量組最為顯著。模型組心肌細(xì)胞AI較假手術(shù)組顯著升高[(57.4±9.8)%與(0.0±0.0)%，P<0.01]；銀杏內(nèi)酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組AI分別為(44.9±8.5)%、(38.9±7.4)%、(26.4±6.1)%，與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B中劑量組、高劑量組AI顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為銀杏內(nèi)酯B低劑量組；D為銀杏內(nèi)酯B中劑量組；E為銀杏內(nèi)酯B高劑量組

圖3各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL，×400)

2.5 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3顯著上調(diào)、且Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B中劑量組、高劑量組Bcl-2表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；Bax、激活型Caspase-3下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2/Bax升高(P<0.01)。詳見圖4和表1。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為銀杏內(nèi)酯B低劑量組；D為銀杏內(nèi)酯B中劑量組；E為銀杏內(nèi)酯B高劑量組

圖4各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)

表1 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

目前，及時(shí)溶栓實(shí)現(xiàn)血流恢復(fù)灌注是急性心肌梗死(AMI)的主要治療方案，再灌注損傷嚴(yán)重影響AMI預(yù)后。既往多項(xiàng)研究表明，心功能異常、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制[5-9]。

本研究通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支方法制作缺血再灌注損傷大鼠模型，該造模方法操作簡(jiǎn)單、成功率高且與臨床AMI癥狀接近，是常用的造模方法[10]。本研究結(jié)果顯示：銀杏內(nèi)酯B治療能改善心電圖波形，抑制心肌組織細(xì)胞病變和細(xì)胞凋亡，減小梗死體積，說明銀杏內(nèi)酯B可抑制心肌缺血再灌注損傷。

激活型Caspase-3在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)及后續(xù)過程中均發(fā)揮重要作用[11]；Bcl-2通過抑制Caspase-3激活、阻止細(xì)胞色素C釋放、降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度從而表現(xiàn)出抑凋亡作用[12]；Bax通過破壞線粒體滲透性、激活Caspase-3表現(xiàn)出促凋亡作用[13]；且Bax與Bcl-2聚合成二聚體相互抑制活性，因此，Bax/Bcl-2比值能實(shí)現(xiàn)二者對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[14]。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)銀杏內(nèi)酯B治療心肌缺血再灌注能上調(diào)抑凋亡Bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡Bax和激活型Caspase-3表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，這可能是銀杏內(nèi)酯B抑制細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡。