葛根素通過NF-кB信號通路調節破骨細胞的分化

于冬冬 趙丹陽 姚嘯生 楊鶇祥 侯德才

1．遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽110032

2．沈陽市第一人民醫院神經內科，遼寧 沈陽110041

絕經后骨質疏松癥(postmenopasal osteoporosis，PMOP)是最常見的原發性骨質疏松癥。PMOP導致骨質疏松性骨折的風險增加［1］，是老年女性骨折的主要原因之一［2］。成骨細胞和破骨細胞的動態平衡是維持骨穩態的重要條件，在PMOP的發病過程中破骨細胞過度活化，同時伴隨著過度的骨吸收［3］。因此，抑制破骨細胞活性及分化仍然是目前PMOP防治的重要手段及方法。

葛根素作為葛根的活性成分，作用于機體發揮不同的藥理學作用，如抗氧化、抗應激、抗感染、抗腫瘤等。筆者前期研究發現葛根素能夠抑制成骨細胞的凋亡，繼而達到防治骨質疏松癥的藥理學作用［4］。有研究發現葛根素能夠防治卵巢切除(OVX)大鼠的骨質疏松、調節破骨細胞的形成，但是具體的潛在機制還不清楚［5］。

本實驗的目的是研究葛根素對破骨細胞形成及分化的影響，探索其潛在的作用機制，為葛根素防治PMOP提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7細胞(ATCC，美國)。

1.1.2 試劑:葛根素(Puerarin，PUE縮寫，南京狄爾格醫藥科技公司。溶于 DMSO，儲存濃度10－5mol/L，－ 20 ℃ 保存);sRANKL(Peprotech，美國);M-CSF(Peprotech，美國);DMEM(Hychone，美國);進口胎牛血清(Hychone，美國);TRAP染色試劑盒(Sigma，美國);Osteoassay surface Mltiple well plate(Corning，美國);NF-кB免疫熒光檢測試劑盒(Beyotime，上海)。

1.1.3 儀器:細胞孵箱(Thermo，美國);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本);免疫熒光顯微鏡(Olympus，日本);AMR-100酶標儀(杭州奧盛儀器有限公司，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠單核/巨噬細胞RAW 264.7培養及誘導分化:小鼠單核/巨噬細胞RAW 264.7培養傳代，未分化培養基含(DMEM、10%胎牛血清、不含抗生素，37℃，5%CO2)。細胞接種于6孔板內，細胞密度:1×104細胞/孔，24 h后換成誘導分化培養液培含(DMEM、10%胎牛血清、15 ng/mL RANKL、15 ng/mLl M-CSF)繼續培養7 d。

1.2.2 WST-1檢測細胞增殖活性:分組:對照組、10－6～10－10mol/L 的 PUE 組。細胞平鋪(5×103細胞/孔)96孔平板中，24 h后更換分化培養基，誘導分化培養7 d 后，細胞經 PUE 處理3、12、24、48、72 h后，每孔加 20 μL WST－1 檢測液。在 37°C、5%CO2的細胞培養箱中孵育1 h。490 nm讀取吸光度值。OD值=(處理后細胞OD值－對照組細胞OD值)/N，n＞3。

1.2.3 TRAP染色檢測破骨細胞分化:分組:A組(對照組)，B組(sRANKL+M-SCF組)，C組(PUE+sRANKL+M-SCF組)。RAW264.7細胞(5×104細胞/孔)在 24孔板內培養，在含和不含 PUE(10－8mol/L)的條件下加入誘導分化培養液誘導分化7 d。細胞TRAP染色根據Sigma染色試劑盒進行操作。

1.2.4 Osteoassay surface Mltiple well plate檢測破骨細胞吸收活性:分組:A組(對照組)，B組(sRANKL+M-SCF組)，C組(PUE+sRANKL+MSCF組)。RAW264.7細胞(5×104細胞/孔)在Osteoassay surface Mltiple well plate板內培養(24孔)，在含和不含PUE(10－8mol/L)的條件下加入誘導分化培養液誘導分化7 d。在培養結束時進行顯微鏡拍照，使用Image J軟件測量吸收面積。

1.2.5 免疫熒光檢測 NF-кB核轉位:分組:A組(對照組)，B組(sRANKL+M-SCF組)，C組(PUE+sRANKL+M-SCF組)。細胞在蓋玻片上并培養過夜，在含和不含PUE(10－8mol/L)的條件下加入誘導分化培養液誘導分化7 d。免疫固定液將細胞固定(室溫15 min)，用免疫洗滌液(含0.1%的Triton X-100)洗滌。用p-p65抗體孵育細胞(以1∶400的比例稀釋)過夜，用DAPI(5 min)染色細胞核，免疫熒光顯微鏡觀察細胞。

1.2.6 Western blot檢測:細胞分 sRANKL+MSCF、PUE+sRANKL+M-SCF組。細胞加入裂解液提取蛋白、定量、上樣、電泳、轉膜、封閉、一抗過夜、二抗孵育、ECL發光法曝光成像，掃描入電腦，n＞3。Image J軟件測定平均灰度值。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 13.0軟件進行統計分析，采用ANOVA方法，數據以均數±標準差(珋x±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 葛根素抑制破骨細胞增殖活性

WST－1法檢測PUE對破骨細胞增殖活性的影響(圖1)。結果顯示，各個濃度的PUE均能抑制破骨細胞的增殖活性(其中PUE 10－8mol/L，預處理3 h，與對照組比較，P＜0.05，n＞3)，PUE(10－8mol/L)作用3 h后具有較大的增殖活性抑制作用。因此，PUE(10－8mol/L)預處理3 h作為實驗用藥濃度及作用時間。

2.2 破骨細胞的形態學觀察

倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(圖2)，未誘導分化的RAW264.7細胞呈圓形，透光度好，邊界清晰，無觸角或少量觸角。加入誘導液后，細胞觸角略增多，細胞略呈短梭形，細胞透光度下降，細胞融合成巨大的多核破骨細胞(破骨細胞的數量=細胞核≥3個細胞的數量/總的細胞數量，誘導分化組P＜0.01，與對照組比較，n＞3);加入 PUE后，破骨細胞的分化受到抑制(P＜0.05，與非PUE處理組比較，n＞3)。

圖1 葛根素抑制破骨細胞增殖Fig．1 Puerarin inhibits osteoclast proliferation

圖2 形態學觀PUE抑制破骨細胞形成 A:對照組;B:誘導分化組(sRANKL+M-SCF誘導分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L 預處理 3 h后，sRANKL+M-SCF誘導分化7 d)。Fig．2 Morphologicalobservation ofPUE inhibiting osteoclastformation．A: Controlgroup; B: Induced differentiation group (sRANKL + M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+MSCF induced differentiation for 7 days)．

2.3 TRAP染色檢測破骨細胞分化

TRAP檢測PUE(10－8mol/L)對破骨細胞分化的影響(圖3)，筆者前期研究發現濃度為15 ng/mL的sRANKL+M-CSF誘導分化7 d具有明顯的誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化的效果［5］。在誘導分化培養基中加入PUE(10－8mol/L)預處理3 h后，RAW264.7細胞誘導分化7 d，結果顯示未加PUE組的破骨細胞分化明顯(P＜0.01，與對照組比較，n＞3)，PUE能夠明顯抑制破骨細胞的分化(P＜0.05，與非PUE處理組比較，n＞3)。

圖3 PUE抑制破骨細胞的分化 A:對照組;B:誘導分化組(sRANKL+M-SCF誘導分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L預處理 3 h后，sRANKL+MSCF誘導分化7 d)。Fig．3 PUE inhibits osteoclast differentiation．A:Control group;B:Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days)．

2.4 Osteo Assay Surface檢測破骨細胞吸收活性

破骨細胞分化后，會吞噬Osteoassay plate的仿生物的骨組織，進而形成吸收池(absorb pit)，吸收池的大小與破骨細胞的吸收活性呈正相關。本研究結果顯示(圖4)，誘導分化組形成明顯的吸收池，達到視野的30%以上(P＜0.01，與對照組比較，n＞3)，加入PUE后，吸收池縮小，提示破骨細胞的吸收活性受到抑制(P＜0.05，與非PUE處理組比較，n＞3)。

2.5 免疫熒光檢測NF－кB核轉位

NF-κB未被激活時被轉運到細胞核內促進NF-κB依賴的基因轉錄。通過免疫染色檢測NF-κB的主要亞基p65是否被轉移到細胞核內，就可以判斷NF-κB是否被激活。本研究結果顯示(圖5)，破骨細胞分化后，p65向細胞核內轉位，PUE能夠抑制其向細胞核內轉位。

2.6 Westerm blot結果檢測

進一步分析PUE抑制成骨細胞分化的潛在機制(圖6)，免疫印跡檢測通路蛋白顯示，sRANKL+M-CSF促進細胞核內p65的磷酸化，其中加入誘導液30 min時p65的磷酸化明顯增多，而60 min時其磷酸化降低。加入PUE后第30 min，p65的磷酸化受到抑制，說明PUE發揮其抑制破骨細胞分化的藥效學機制通過抑制NF-κB信號通路完成(P＜0.01，與PUE+sRANKL+M-CSF作用組比較，n＞3)。

圖4 PUE抑制破骨細胞的吸收活性 A:對照組;B:誘導分化組(sRANKL+M-SCF誘導分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L 預處理 3 h后，sRANKL+M-SCF誘導分化7 d)。Fig．4 PUE inhibits the absorptive activity of osteoclasts．A: Controlgroup; B: Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days)．

3 討論

PMOP導致骨質疏松性骨折的風險增加［6-7］。在PMOP的發病過程中，破骨細胞過度形成及分化，因此，抑制破骨細胞形成及分化仍然是PMOP治療的重要策略［3］。

目前臨床使用的抗PMOP的藥物，長期使用都有一些局限性。例如，長期使用雙膦酸鹽治療會引起相關的心房顫動、頜骨壞死和嚴重抑制骨轉換［8］。此外，長期使用SRMS藥物(雷洛昔芬)導致靜脈血栓栓塞和致命中風已被報道［9］。因此，需要一種不僅可以提高骨密度、而且還可以促進新骨的形成、長期用藥沒有有嚴重副作用的新藥。

圖5 PUE抑制NF-κB核轉位 A:對照組;B:誘導分化組(sRANKL+M-SCF誘導分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L預處理3 h后，sRANKL+M-SCF誘導分化7 d)。Fig．5 PUE inhibits nuclear translocation of NF－κB．A:Control group;B:Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+MSCF induced differentiation for 7 days)．

圖6 PUE抑制P65磷酸化Fig．6 PUE inhibits P65 phosphorylation

葛根素作為葛根的活性成分，抵抗機體各種疾病，如心血管系統疾病、腦部疾病、腫瘤、及炎癥等。葛根素具有抗骨質疏松的藥效學作用，能夠預防去卵巢(OVX)大鼠的骨丟失，提高骨量，而且不增加雌激素樣的作用。最近的研究報道，葛根素能夠抑制破骨細胞形成，抑制骨丟失［4］，但潛在的還不清楚。

本研究發現，葛根素能夠抑制破骨細胞的分化，加入葛根素后破骨細胞不僅數量減少。同時吸收池實驗顯示，加入葛根素后破骨細胞的吸收能力明顯下降，說明破骨細胞的活性受到抑制，這對于防治PMOP來說，具有非常重要的意義。

NF-κB信號通路在調節破骨細胞的形成及分化中發揮重要作用［10］。本研究發現，葛根素抑制NF-κB的核心蛋白p65的磷酸化，抑制其從細胞漿向細胞核轉位，進而防止破骨細胞形成。因此，葛根素通過NF-κB信號通路抑制破骨細胞的分化，進而達到防治PMOP的藥理學作用。

目前研究骨質疏松癥的發病機理雖然較多，但是基于NF-κB信號通路，從破骨細胞分化為研究的切入點，探索中醫藥活性成分葛根素對破骨細胞分化機制的相關研究較少。因此，本研究對于中醫藥臨床防PMOP具有一定的意義。