環狀RNA與骨科相關疾病研究進展

陳德龍 陳鵬 王粵淇 王海彬

1．廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州510405

2．廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州510405

非編碼 RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子，近20年來，具有調控作用的非編碼RNA分子被發現及其功能研究，大大改變了人們對RNA分子的認知，也極大深化了人們對基因表達調控的理解。其中，環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類通常由一個以上外顯子構成的環形RNA分子，概念最初是由Sanger等［1］于1976年提出的，他發現某些高等植物的類病毒是單鏈、共價閉合的環狀 RNA分子。然后在1979年通過使用電子顯微鏡驗證了環狀RNA存在于幾個真核細胞中［2］。1986年，在感染丁型肝炎病毒后，人類首次觀察到circRNA［3］。在真核生物中，規范剪接由剪接體去除內含子并將外顯子連接成線性 RNA轉錄產物。20多年前，Nigro等［4］發現circRNA時，人們認為它是錯誤剪接生成的副產品或逃逸內含子套索的中間產物。自2012年以來，隨著生物信息學和高通量測序的快速發展和廣泛應用，這種觀點發生了巨大變化［5］。最近的許多報道證明了circRNA在病理生理學中的重要性，這些circRNA可以作為 miRNA海綿發揮作用［6-7］，調節轉錄和基因表達［8-9］，有些甚至翻譯成蛋白質［10-11］。circRNA參與各種疾病的發病機制，具有序列高度保守、結構穩定、豐度高、有一定的組織特異性和疾病特異性［12］，使它們成為生物學領域的熱點。circRNA作為疾病診斷、預后生物標志物和治療靶標也具有潛在的價值［13］。本文簡要描述了circRNA的特征、生物起源、分類和功能，并且強調了circRNA與多種骨科疾病之間的關系。

1 circRNA的特征

circRNA廣泛存在于真核細胞中，通常由1～5個外顯子產生［14］，主要位于細胞質中［5］，少部分含有內含子的circRNA起源于細胞核［9］。circRNA的長度在幾百到幾千個核苷酸之間［15］，平均547個核苷酸［14］，大多數circRNA的半衰期超過48 h。重要的是，circRNA來自非規范的可變剪接，其將剪接供體連接至上游剪接受體并形成共價閉合環，沒有5’帽子或3’多聚A尾，并通過共價鍵環化。這些特征賦予circRNA對核酸外切酶RNase R的抗性，在組織和血漿中更穩定。而且circRNA在細胞、組織中廣泛表達［16-17］，具有成為生物標志物和治療靶標的潛力。

2 circRNA的分類

circRNA的生成與可變剪接相關，而可變剪接是真核基因表達中必不可少的步驟，它受到剪接體和核糖酶的調控。circRNA由外顯子、內含子、基因間區域、以及 5’或 3’非翻譯片段產生［9，18］。circRNAs主要分為3類:外顯子環狀 RNA(exonic circular RNAs，ecircRNAs)、內 含 子 環 狀 RNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)、外顯子-內含子環狀 RNA(exon-intron circular RNAs，EIciRNAs)。

3 circRNA的生物起源

3.1 ecircRNA的生物起源

大多數ecircRNA來自外顯子，關于ecircRNA生物合成已經提出了3個主要模型:(1)套索驅動環化(也稱為外顯子跳躍)。它是位于5’端的外顯子受體和位于3’端外顯子供體兩者共價結合后形成含外顯子的套索中間體，然后去除套索中的內含子以產生ecircRNA［12］。(2)內含子配對驅動環化(也稱為直接反向剪接)。通過側翼內含子的直接堿基配對形成環狀結構，然后切除環內反向剪接的內含子，從而產生ecircRNA［12］。(3)重新剪接驅動環化。在通過經典前mRNA剪接合成成熟mRNA后，發生反向剪接和環化，導致ecircRNA形成［19］。一些RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBP)在此過程中充當調節因子，例如muscleblind(MBL)剪接因子可以將側翼內含子生成的circMbl前體環化成circMbl，并且circRNA的生成受到MBL表達水平的調控［20］。RBP與前mRNA的側翼內含子內的特定序列結合，可以通過穩定剪接或抑制線性RNA來調節circRNA形成。

3.2 其他類型circRNA的生物起源

EIciRNA的生物合成與ecircRNA過程類似，唯一的區別在于內含子是完全剪接(ecircRNA)或部分剪接(EIciRNA)。與外顯子circRNA形成不同，ciRNA的產生主要取決于內含子兩端的共有基序，即5’剪接位點附近存在一段7nt左右富含GU堿基的結構，分支點附近存在一段11nt左右富含C堿基的結構。因此，ciRNA不是以3’-5’磷脂結合，而是以 2’-5’磷脂連接［9］。

4 circRNA生物學功能

4.1 調節線性RNA轉錄

circRNA影響剪接過程，是選擇性剪接和轉錄的關鍵調節因子。它們不僅可以增強線性RNA的轉錄，而且還能抑制它們的轉錄。外顯子circRNAs是主要種類，在合成過程中與規范剪接互相競爭(見圖1)。一方面，規范剪接修飾前mRNA，形成線性RNA，外顯子對這一過程必不可少;另一方面，當circRNA和線性RNA的形成需要共同的外顯子時，需要相互競爭。此外，這兩個過程可能共享相同的位置［21］。對于由內含子(如ciRNA和EIciRNA)形成的circRNA，一些研究揭示了這些circRNAs能調節親本基因的表達。已經證明的ciRNA或EIciRNA，例如c-sirt7可以與聚合酶II復合物相互作用，相應基因錨蛋白重復結構域52(ankyrin repeat domain 52，ANKRD52)和去乙?；?7(sirtuin 7，SIRT7)的表達水平下降［22］。如上所述，在circRNA形成期間，調節其親本基因的表達，這是circRNA在其他功能中發揮作用的先決條件之一。

4.2 miRNA海綿

miRNA作為在轉錄后水平基因表達的關鍵調控因子，它可以根據堿基互補配對原則結合到互補的mRNA位點上［23-24］，miRNA的改變會調控mRNA和蛋白質的表達。circRNA是一種擁有miRNA反應原件(microRNA response element，MREs)的競爭性內源性 RNA分子，具有 miRNA海綿作用。ceRNA的缺失和出現會通過影響miRNA功能活性從而調節基因表達。具有互補序列的circRNA可以與其靶miRNA結合，從而抑制這些miRNA的功能［25］。然而，海綿作用是否是circRNA的普遍功能仍在討論中。

圖1 CircRNA生物學功能示意圖(自擬)Fig．1 Biological function of circRNA

CiRS-7也稱為CDR1as，已經被證明可以作為miRNA海綿的典型例子［26-27］。具有超過70個常規miR-7結合位點的CiRS-7由CDR1as基因的反義轉錄物形成［26］。此外，CIR-7不能被miRNA-7介導的RNA誘導沉默復合物體(RNA-induced silencing complex，RISC)降解［28］。miR-7 是眾多信號通路中的關鍵參與者之一，ciRS-7-miR-7軸廣泛表達于各種癌癥，如非小細胞肺癌和結腸癌［29-30］。

4.3 蛋白質海綿

circRNA還可以作為RNA結合蛋白的海綿來調節蛋白質水平。RBP可參與許多生物活性，例如細胞增殖、分化，細胞凋亡、衰老，細胞對氧化應激的反應等。據報道，circRNA可以結合多個RBPs，例如 RNA 聚合酶 II(RNA polymerase II，Pol II)、Argonaute(AGO)蛋白、MBL、RNA結合蛋白Quaking(QKI)等，通過相互作用形成RNA-蛋白質復合物。這種與RBPs的相互作用類似與miRNA海綿，導致RBPs的消耗和減少與RNA靶標的互相作用。在蒼蠅和人類中發現的circMBL可以在多個結合位點結合MBL蛋白［25］。另外，CDR1As可以連接和切割miRNA AGO蛋白，抑制其翻譯并促進其降解［18］。

4.4 與蛋白質相互作用

circRNA可以與蛋白質相互作用以影響細胞行為。例如circ-FOXO3通過與細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和 CDK 抑制劑P21結合，阻礙CDK2使細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E磷酸化，從而抑制細胞周期［31］。

4.5 蛋白質翻譯

circRNA可能不是真正的一類ncRNA，因為其中有一些circRNA可以翻譯蛋白質。早在1995年，研究人員發現當circRNA含有內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)元件時，真核生物核糖體能啟動翻譯［32］。當將IRES插入含有裂解GFP的小基因中時，得到的circRNA能產生大量的GFP蛋白［33］。盡管已經進行了一些研究，但是circRNA的翻譯細節仍然未知，仍需進一步探索。

5 circRNA在骨科方面的運用

5.1 骨細胞

轉錄因子BMP2屬于轉化生長因子β超家族，是重要的人類細胞因子之一。它能誘導骨和軟骨形成，并在胚胎生長、細胞生長和分化、骨發育和骨折修復中發揮重要作用。用BMP2處理的MC3T3-E1細胞共有158個差異表達的circRNA，其中74個上調，84個下調。在 BMP2處理后，PCR驗證 hsa_circ_0005846、hsa_circ_0019142和 hsa_circ_0010042的表達顯著增加。hsa_circ_0005846和hsa_circ_0 019 142分別與51和21個miRNA相互作用，并且都海綿樣作用于 miR-7067-5p，參與 FGF、EGF、PDGF 和Wnt信號通路，調節細胞生長和分化［34］。

在小鼠破骨細胞發育的不同階段存在共同表達的circRNA。circRNA-miRNA協同作用在破骨細胞形成中起重要作用。對于破骨細胞前期，147個circRNA和119個miRNA上調，109個circRNA和941個miRNA下調。對于成熟的破骨細胞，78個circRNA和38個miRNA上調，135個circRNA和24個miRNA下調。對于活化的破骨細胞，111個circRNA和94個miRNA上調，45個circRNA和975個miRNA下調。在OC發生過程中的所有階段，19個circRNAs和22個miRNAs都上調，5個circRNAs和 15miRNAs都下調［35］。

骨髓間充質干細胞是多能干細胞，廣泛運用于組織工程研究，骨髓間充質干細胞向成骨方向分化是骨再生的希望。Zhang等［36］利用RNA-seq技術探究骨髓間充質干細胞向成骨分化過程中明顯異常表達的circRNAs和miRNAs，在第0天和第7天的比較中發現差異表達的共有3 938個上調的circRNAs，1 505個下調的circRNAs和42個上調的miRNAs，18個下調的miRNAs。通過ALP染色和茜素紅染色證實沉默circIGSF11促進骨髓間充質干細胞向成骨分化并增強miR-199b-5p的表達。

5.2 骨性關節炎

人骨性關節炎(osteoarthritis，OA)軟骨中存在許多異常表達的circRNA，這些circRNA可能參與了OA的發病機制。在一項研究中，Liu等［37］發現與正常軟骨相比，總共有71個circRNA在OA軟骨中差異表達，其中有16個上調，55個下調。其中OA中circRNA-CER的表達是正常組的2.5倍。白介素1(Interleukin-1，IL-1)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是 OA 關鍵的炎性介質，在IL-1和TNFα刺激軟骨細胞下，CircRNA-CER靶向miR-136調節基質金屬蛋白酶 3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)、軟骨Ⅱ型膠原蛋白(collagen type II，COL2)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表達降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。另一項研究中，在骨關節炎病人中，受損的軟骨相比完整的軟骨共有104個circRNAs差異表達，其中44個上調，60個下調。軟骨細胞在應力刺激下，circRNA-MSR表達增加，并可抑制TNF-α的表達并增加ECM的形成，增加COL2和Aggrecan的表達量［38］。

炎癥是OA軟骨病理學的重要驅動因素。eNAMPT也被稱為visfatin，在人類OA軟骨細胞中抑制蛋白多糖的合成并增加基質降解酶的表達。has-circ-0005105不僅可以促進NAMPT的表達，而且可以促進前列腺素E2、IL-6和IL-8的產生。細胞凋亡誘導軟骨細胞數量減少在OA軟骨組織的退化中起重要作用［39］。Li等［40］報道 has_circ_0045714可通過miR-193b靶基因IGF1R促進軟骨細胞增殖和抑制軟骨細胞凋亡。

5.3 骨肉瘤

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)已成為兒童及青少年時期死亡率最高的癌癥，具有局部侵蝕性和易于全身轉移的特征。Caspase-1是一種半胱氨酸蛋白酶，已被證明能夠蛋白水解并激活IL-1β和IL-18等炎性細胞因子，從而導致形成炎性微環境，在骨肉瘤組織中呈高表達。circ-0016347海綿樣作用于miR-214，上調具有致癌潛力半胱天蛋白酶-1(caspase-1)的表達，促進骨肉瘤的增殖和侵襲［41］。在骨肉瘤患者中，circHIPK3的表達與 Enneking分期(P=0.042)和肺轉移(P=0.036)顯著相關。ROC曲線下面積為0.783，靈敏度和特異度分別為0.56和0.84。Kaplan-Maier分析還顯示circHIPK3的低表達與OS患者的總體存活時間和預后較差相關。此外，功能分析表明circHIPK3過表達顯著抑制體外OS細胞增殖、遷移和侵襲［42］。在另外一項研究中，circUBAP2可以作為miR-143的海綿發揮作用并抑制miR-143的表達，從而上調骨肉瘤中抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制骨肉瘤細胞的凋亡［43］。總之，circRNA在骨肉瘤診斷和預后方面具有重要價值，未來的工作中需要更多的樣本來進一步確定circRNA的作用。

6 總結

隨著高通量測序技術和生物信息學的進步，對circRNA的研究越來越受到關注。circRNA形成的機制是多種多樣的，產生不同類型的circRNA具有不同的功能，例如調節線性RNA轉錄、miRNA和蛋白質海綿、翻譯蛋白質等。這些復雜的功能使circRNA能夠通過各種信號通路參與許多疾病的發生和發展，特別是對于骨科疾病，為骨科疾病的發病機制提供了新的見解。circRNA結構穩定、豐度高、有一定的組織特異性和疾病特異性，可能成為臨床診斷生物標志物和治療靶點，但目前均是體外研究，結果需要在體內驗證。因此，為了充分了解circRNA在骨科疾病發展中的分子機制，必須進行更廣泛的研究。