苦蕎芽苗茶飲料發酵前后營養、風味及抗氧化活性的變化

李 俊 盧 揚 趙 剛 向達兵 陳中愛 劉 輝

(1.貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003；2.貴州省農業科學院食品加工研究所，貴州 貴陽 550006；3.農業農村部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106)

苦蕎被譽為藥食同源植物，除了蛋白質、維生素等基本營養元素外，還富含蘆丁、槲皮素等黃酮類物質，營養素含量豐富，比例均衡[1]。研究[2]表明，黃酮類物質具有較高的食用和藥用價值，具有抗菌消炎等作用，長期食用還能增強人體免疫力。因此，苦蕎已經成為食品加工的一個熱點，已經開發出苦蕎醋、苦蕎茶、苦蕎酸奶等各種特色保健食品。有研究[3]發現，萌發后的苦蕎籽粒，黃酮類物質的含量會顯著提高，其中蘆丁含量會增加4～6倍。但現階段國內外對苦蕎產品的開發主要集中于苦蕎籽粒，對苦蕎萌發后的芽苗研究還較少。

乳酸菌具有協調人體腸道菌群的比例、降低膽固醇、增強免疫力等一系列功效[4]。通過乳酸菌發酵不僅能賦予制品新的保健功能，而且還可使制品產生特有的風味。Cho等[5]開發出的乳酸菌發酵飲料蛋白含量高，脂肪含量低，活菌數高，抗氧化及抗菌活性顯著增強，感官性狀良好。王振斌等[6]采用乳酸菌和酵母菌發酵葛根汁，發酵6 d葛根汁總黃酮含量提高了17.72%，γ-氨基丁酸質量濃度增加了279.17%，必需氨基酸總量增加了65.58%，乳酸濃度增加，產品中風味物質的含量比葛根汁有所提高。但現階段關于乳酸菌發酵對苦蕎制品中營養及風味物質的研究尚未見報道。

本研究以苦蕎芽苗及苦蕎茶湯為原料，采用植物乳桿菌發酵，利用液相色譜、氨基酸分析儀及氣質聯用等檢測方法對發酵前后苦蕎芽苗茶飲料的蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、總黃酮、氨基酸、揮發性化合物、DPPH和ABTS自由基清除率進行分析，探究發酵前后苦蕎芽苗茶飲料營養、風味及抗氧化活性的變化，為苦蕎飲料的研制提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎籽粒：貴米苦18號，貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心，溫度25 ℃、濕度80%條件下萌發8～10 d左右可得萌發苦蕎芽苗；

苦蕎茶：貴州省威寧縣東方神谷有限責任公司；

植物乳桿菌(GIM1.380)：廣東省微生物菌種保藏中心；

蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷標準品：美國Sigma公司；

果葡糖漿：食品級，加福得食品(北京)有限公司；

甲醇：液相色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸、鹽酸、苯酚、檸檬酸鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2′-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、過硫酸鉀：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

所用水為超純水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：1260型，配紫外檢測器，色譜柱為Shiseido C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，美國Agilent公司；

氣相色譜質譜聯用儀：HP6890/5975C型，色譜柱為FB-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，美國Agilent公司；

氨基酸分析儀：S433D型，德國Sykam公司；

均質機：BRS-200型，安徽博進化工機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦蕎芽苗茶飲料制備 參照文獻[7]。苦蕎茶湯與苦蕎芽苗按照4∶1(質量比)的比例混勻后打漿，用4層紗布過濾雜質后，4 000 r/min離心5 min，按照1∶10(體積比)的比例加入純凈水進行稀釋，加入穩定劑，均質(25 MPa，60 ℃)后在121 ℃條件下滅菌5 min，按0.6%的菌劑添加量接種植物乳桿菌(液體MRS培養基37 ℃培養48 h)，37 ℃發酵24 h，發酵結束。

1.3.2 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法[8]。制作的標準曲線為：Y= 0.318 6X+0.002，R2= 0.999 1。樣品平行測定3次取平均值，根據標準曲線計算相應的總黃酮含量(μg/mL)。

1.3.3 不同黃酮物質含量測定 采用高效液相色譜法。根據文獻[9]，修改如下：制成每100 mL分別含蘆丁100 mg，山奈酚-3-O-蕓香糖苷50 mg，槲皮素20 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液。取5.0 mL飲料，加入75%乙醇50 mL，超聲30 min，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，過濾，即得供試品溶液。色譜條件：流動相：甲醇(A)∶0.1%磷酸溶液(B)=55∶45(體積比)；波長355 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

1.3.4 氨基酸測定 參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》的方法，水解后直接用氨基酸分析儀對苦蕎芽苗飲料中的氨基酸進行分析。

1.3.5 揮發性成分測定 取樣品8 mL，置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，放置磁力攪拌器上(轉速120 r/min)，插入裝有2 cm×50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在60 ℃水浴中頂空萃取45 min，快速移出萃取頭并插入色譜儀進樣口(溫度250 ℃)，熱解析5 min進樣。色譜條件參照文獻[10]，對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist2014和Wiley275標準質譜圖，確定揮發性化學成分。

1.3.6 DPPH自由基清除的測定 參照Yang等[11]的方法并稍作改動，將發酵前后飲料稀釋成不同濃度，分別置于10 mL試管中，加入3 mL DPPH溶液并振搖10 s，室溫靜置，避光反應30 min。在波長517 nm處測其吸光值，以不加樣品的DPPH溶液作為空白對照。

1.3.7 ABTS自由基清除率測定 參照Guo等[12]的方法并稍作改動，將發酵前后飲料稀釋成不同濃度，分別置于10 mL試管中，加入3 mL ABTS工作液并振搖10 s，室溫靜置，避光反應6 min。在波長734 nm處測其吸光值，以不加樣品液的ABTS工作液為空白對照。

1.4 數據處理

采用Origin(Version 8.6)進行作圖，采用SPSS(Version 17.0)進行統計學分析，P<0.05認為有統計學顯著性差異，P<0.01認為有統計學極顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 發酵前后苦蕎芽苗茶飲料中黃酮含量變化

發酵前后苦蕎芽苗茶飲料中黃酮含量變化見圖1。由圖1可知，發酵后蘆丁含量基本保持不變，但槲皮素和山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量有稍許降低，總黃酮含量也從(120.6±1.9)μg/mL降至(114.6±1.7)μg/mL。這些結果與Shyu等[13]關于柑橘果皮中黃酮類物質的報道一致，柑橘果皮中黃酮類物質經發酵后也有不同程度的降低。可能是，一部分黃酮被消耗或是經修飾轉化為其他物質，Chen等[14]報道了發酵對黃岑莖葉提取物中黃酮類物質的生物轉化，發現L.brevisRO1菌株能夠有效地提升黃酮類物質的生物轉化率。但關于苦蕎芽苗茶飲料中黃酮類物質降低的原因還有待進一步研究。

字母不同代表發酵前后測定結果差異顯著(P<0.05)圖1 發酵前后苦蕎芽苗茶飲料中黃酮含量對比Figure 1 Comparison of flavonoids content intea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

2.2 發酵前后苦蕎芽苗飲料中氨基酸含量變化

苦蕎芽苗茶飲料發酵前后氨基酸含量見表1。苦蕎芽苗茶飲料中包含6種必需氨基酸(EAA)和11種非必需氨基酸(NEAA)，但經乳酸菌發酵后蘇氨酸并未檢出。發酵前NEAA和總氨基酸(TAA)含量顯著高于發酵后 (P<0.05)，可能是氨基酸作為乳酸菌發酵的氮源物質被吸收利用，導致發酵后氨基酸含量降低；同時發酵過程會產生一定的風味，如蘇氨酸、纈氨酸等會通過微生物轉化產生特征性風味物質乙醛[6]。發酵后EAA/TAA的比例為38.32%，EAA/NEAA為62.13%，而發酵前EAA/TAA和EAA/NEAA分別為26.89%和36.80%，發酵后EAA/TAA和EAA/NEAA比例顯著高于發酵前。FAO/WHO[15]提出的理想蛋白質標準為：人體EAA/TAA在40%左右，EAA/NEAA在60%左右。從這一角度分析，發酵有利于苦蕎芽苗茶飲料中蛋白質性能的提高。

根據FAO/WHO[15]模式制定的苦蕎芽苗飲料發酵前后氨基酸評分見表2。蘇氨酸在發酵前后苦蕎芽苗汁中評分最低，為第一限制性氨基酸[10]。氨基酸評分越接近1，說明該食品氨基酸比例越接近FAO/WHO推薦模式。苦蕎芽苗茶飲料發酵前后大部分氨基酸評分都低于l，表明其必需氨基酸構成有一定的提升空間。

表1發酵前后苦蕎芽苗茶飲料中氨基酸含量對比?
Table 1Comparison of amino acid content in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

mg/kg

? a代表發酵前后同一種氨基酸測定結果對比顯著 (P<0.05)，未標注代表結果不顯著。

2.3 發酵前后苦蕎芽苗茶飲料中揮發性風味成分變化

通過對發酵前后苦蕎芽苗茶飲料中各揮發性成分提取、分離、鑒定，求得其相對含量，結果如表3、4所示。共分離鑒定出8類54種揮發性物質，包括醛類(7種)，醇類(14種)，酮類(9種)，酯類(11種)，酸類(4種)，烯類(2種)，烷類(1種)，雜環類(3種)。王灼琛等[16]對苦蕎粉、苦蕎殼、苦蕎麩皮揮發性成分進行了分析，苦蕎粉含有揮發性化合物成分44種，苦蕎殼含有46種揮發性物質，苦蕎麩皮含有20種揮發性物質。余麗等[17]從苦蕎中分析出了35種揮發性成分，包括酯類、烴類、酮類、醛類和醇類，以酯類和醛類為主。本試驗檢測出發酵前苦蕎芽苗茶飲料中含有46種揮發性物質，發酵后含有43種揮發性物質。

表2 苦蕎芽苗茶飲料發酵前后氨基酸評分對比?Table 2 Comparison of amino acid score in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

? 氨基酸評分表示1 g待測蛋白中該氨基酸占1 g標準蛋白中該種氨基酸的比值。

表4苦蕎芽苗茶飲料發酵前后揮發性物質分析匯總
Table 4Analysis and summary of volatile components in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

從表3可以看出，發酵前所有風味物質中2-乙酸庚酯含量最高，達到22.569%，發酵后所有風味物質中2-乙酸壬酯含量最高，達到39.986%，可能來源于飲料中添加的穩定劑(黃原膠、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉)，且發酵過程中發生了一定的化學變化。

從表4可以看出，發酵后酯類、酸類、烯類、烷類和雜環類物質均有不同程度升高，而醛類、醇類、酮類物質明顯降低。酯類化合物相對含量從39.331%升高到58.687%，它是發酵飲料中一種很重要的揮發性風味物質，具有特殊的水果味和花香味，同時酯類物質的閾值一般較低，對整個體系風味的貢獻很大[18]。發酵前醇類物質為主要揮發性物質，發酵后醇類物質含量從39.680%降低至29.933%，醇類一般具有芳香、花香或水果香，可以結合有機酸形成酯類物質，改善發酵后產品的風味。發酵后乙醇和2-壬醇含量顯著升高，而乙醇具有醇香味，對發酵后產品風味影響較大。醇類物質雖然含量較高，但閾值也較高，對發酵后飲料的香氣起到柔和作用[19]。發酵后酸類物質含量從0.196%升高到3.045%，主要的風味物質是乙酸，是因為乳酸菌代謝會產生辛酸、癸酸等有機酸，有機酸能使飲料口感清爽并帶有新鮮的水果香，提升產品的滋味和口感。烷烴閾值較高，對風味的影響不大。而揮發性烯烴具有良好的香氣，其中檸檬烯具有類似于檸檬的特異香味[20]。因此，通過發酵，苦蕎芽苗茶飲料中閾值較低的芳香性風味物質含量明顯提升，對飲料的風味具有有益的影響。

2.4 發酵對苦蕎芽苗茶飲料抗氧化活性的影響

通過DPPH和ABTS自由基清除率兩種測定方法對比發酵前后苦蕎芽苗茶飲料的抗氧化活性，結果如圖2所示。飲料發酵后DPPH自由基清除率從(68.32±0.73)%升高至(72.19±0.52)%，ABTS自由基清除率從(61.25±0.49)%升高至(63.18±0.65)%，均有一定提升。賈紅玲[21]報道了乳酸菌發酵對全稻芽抗氧化性能的影響，DPPH和ABTS自由基清除率都有顯著提升。梁斐等[22]報道葎草經乳酸菌發酵后，其總黃酮DPPH自由基清除率顯著高于對照組和自然發酵，對ABTS自由基的清除率顯著高于自然發酵組。乳酸菌發酵能夠提高DPPH和ABTS自由基清除率，可能有以下3種原因：① 發酵過程中苦蕎芽苗茶飲料因微生物的代謝活動自身活性物質發生改變，同時代謝出新的活性物質；② 發酵可能造成苦蕎芽苗茶飲料中黃酮種類和結構改變，不同種類和結構的黃酮對DPPH和ABTS自由基清除率差異較大，增加了其抗氧化活性；③ 乳酸菌活菌的存在對其抗氧化活性也有所提高。因此，乳酸菌發酵可以提高苦蕎芽苗茶飲料的抗氧化活性。

字母不同代表發酵前后測定結果差異顯著(P<0.05)圖2 苦蕎芽苗茶飲料發酵前后抗氧化活性對比Figure 2 Comparison of antioxidant activity in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

3 結論

對發酵前后苦蕎芽苗茶飲料中營養、風味及抗氧化活性的變化規律進行了研究。試驗結果顯示，發酵后蘆丁含量基本保持不變，總黃酮含量稍微降低，EAA/TAA達到38.32%，EAA/NEAA達到62.13%，顯著高于發酵前，蛋白質更為均衡，但必需氨基酸評分不高。分離鑒定出8類54種揮發性物質，發酵后閾值較低的芳香性風味物質含量明顯提升，對飲料的風味具有有益的影響。發酵后DPPH自由基清除率從(68.32±0.73)%升高至(72.19±0.52)%，ABTS清除率從(61.25±0.49)%升高至(63.18±0.65)%，乳酸菌發酵可以提高苦蕎芽苗茶飲料的抗氧化活性。總體來說，乳酸菌發酵可以提高苦蕎芽苗茶飲料的營養價值，具有一定的應用前景，但發酵過程會破壞其中的一些有益成分，下一步需要更深層次的研究其作用機理，全面提升產品品質。