白藜蘆醇預(yù)處理通過STIM1通路減少鈣離子內(nèi)流減輕心肌缺血再灌注中的損傷

徐 寒，吳繼雄*

（安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230000）

急性心肌梗死作為當今世界上致死率最高的疾病之一，最有效的治療方式為及時開通冠脈血管，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療以及冠狀動脈旁路移植等是最有效的治療方式，但也同時帶來了心肌缺血再灌注損傷的風險[1]。

Ca2+作為細胞內(nèi)的第二信使，缺血期心肌細胞Na+-K+-ATP酶活性降低，細胞內(nèi)Na+和H+迅速增加；再灌注期細胞鈉-鈣交換蛋白和鈉-氫交換體被激活[2-3]。此外，再灌注時產(chǎn)生的大量氧自由基致使心肌細胞膜和肌質(zhì)網(wǎng)膜通透性增加，激活凋亡相關(guān)蛋白，導致細胞發(fā)生凋亡[1，6，8]。近年的研究證實，鈣庫操作性鈣離子通道是介導胞外Ca2+進入細胞內(nèi)的重要通道之一[4，7]。白藜蘆醇具有強大的抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血管舒張功能、抗血小板聚集等作用。而抑制鈣離子內(nèi)流，減輕鈣離子超載也已被證實是白藜蘆醇防治MIRI的作用機制之一[7]。

1 材料與方法

1.1 乳鼠心肌細胞提取

選擇SD大鼠出生1～3天的乳鼠，消毒后再胸骨左緣、第四肋間縱向剪斷肋骨，抬起乳鼠胸部，心臟可自行從胸腔中彈出，胰酶過夜，加入膠原酶消化至沒有完整心肌組織。

1.2 心肌細胞缺氧復氧模型

原代心肌細胞培養(yǎng)72小時后，改為PBS液，于37℃、95%N2、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h。后更換為含10%FBS的培養(yǎng)基，于37℃、20%O2、5%CO2中培養(yǎng)3h。

1.3 MTS細胞活力測定

在96孔板中，吸出原培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后每孔100μL培養(yǎng)基加入20μL MTS液。加入后在37℃，5%CO2的環(huán)境下避光孵育2小時。

1.4 Western blot

常規(guī)配制分離膠和濃縮膠，每孔加入10～50 μg蛋白上樣量，進行電泳。采用濕轉(zhuǎn)法，開始轉(zhuǎn)膜；以一抗稀釋液稀釋一抗，膜放入一抗內(nèi)，4℃孵育過夜；加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h.

1.5 Ca2+測定

為測定細胞內(nèi)Ca2+的含量，在室溫下加入Flu-3-AM液，孵育30分鐘。在熒光顯微鏡下拍照分析。

1.6 腺病毒轉(zhuǎn)染

心肌細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗后加入腺病毒，37℃，5%CO2培養(yǎng)30分鐘后，使用熒光顯微鏡拍攝及分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤（Mean±EM）表示，采用GraphPad Prism Software Version 5.0統(tǒng)計程序進行統(tǒng)計學分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇預(yù)處理可以減輕心肌細胞缺氧復氧損傷

結(jié)果表明，H/R損傷組MTS法測定的細胞活力低于對照組，白藜蘆醇預(yù)處理能夠提高細胞活力（圖1A）。實驗表明，H/R損傷組的LDH釋放明顯高于對照組（圖1B）。白藜蘆醇的預(yù)處理可以使STIM 1表達下調(diào)，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax、Cleaved caspase-3表達（圖1C）。

2.2 STIM1過表達可以增加心肌細胞在缺血再灌注中心肌細胞的損傷，增加凋亡蛋白的表達

將腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞，并進行缺氧復氧損傷。轉(zhuǎn)染效果由熒光顯微鏡下觀察及WB確定（圖2A）。預(yù)處理后凋亡蛋白顯著下降，但這一保護作用部分被STIM1過表達所阻斷（圖2B和2C）。

圖1 （A）不同劑量白藜蘆醇對體外培養(yǎng)心肌細胞活力的影響（P＜0.05）。（B）白藜蘆醇對培養(yǎng)心肌細胞壞死的影響。*P＜0.0 5。（C）不同劑量組凋亡蛋白WB結(jié)果，與對照組比較*P＜0.05；與H/R組比較#P＜0.05。Ca2+熒光強度經(jīng)白藜蘆醇處理后明顯降低。與對照組比較*P＜0.05，#P＜0.05。

圖2 （A）48小時后心肌的腺病毒感染效率（B）腺病毒轉(zhuǎn)染的NRVC的細胞活力，*P＜0.05與對照組比較，#P＜0.05與I/R組比較。（C）在STIM 1高表達心肌細胞中，白藜蘆醇預(yù)處理組凋亡蛋白和STIM1表達與對照組比較P＜0.05。

3 討 論

我們研究了原代心肌細胞缺氧復氧處理，結(jié)果表明，白藜蘆醇通過抑制STIM 1的表達并減少細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，減輕H/R誘導的細胞損傷。同時，能夠增加Bcl-2表達、降低促凋亡蛋白的表達，這些結(jié)果揭示了白藜蘆醇預(yù)處理在心肌缺氧復氧中的保護作用。此外，STIM 1過表達的腺病毒載體轉(zhuǎn)染顯著提高細胞內(nèi)鈣離子水平，這與心肌細胞缺氧復氧后引起的STIM1表達增加是同時發(fā)生的。

我們檢測了H/R損傷后凋亡蛋白的變化。結(jié)果表明，白藜蘆醇能明顯降低H/R損傷引起的細胞凋亡。同時，我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇預(yù)處理可以顯著上調(diào)bcl-2和下調(diào)Bax的表達[4-6]。此外，轉(zhuǎn)染STIM 1特異性腺病毒載體的NRVCs在白藜蘆醇預(yù)處理后可引起細胞凋亡增加。在白藜蘆醇處理和H/R損傷后，STIM1過度表達導致Bcl-2降低，Bax和Cleaved caspase-3表達增加。因此，上述結(jié)果提示，抑制STIM 1介導的細胞內(nèi)Ca2+積累和隨后引起的細胞凋亡可能是白藜蘆醇心肌保護作用的作用機制之一。