外周血微小RNA-216a與小兒病毒性心肌炎的相關性研究

施帥，趙佳，白曉鵬，李學奇，孫超宇

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：（1）年齡0～14 歲；（2）無先天性心臟病或心臟畸形。排除標準：（1）伴有嚴重臟器功能障礙者；（2）合并免疫系統疾病、代謝系統疾病者；（3）其他類型心肌炎者。

1.2 一般資料 選取2018年1月—2019年1月哈爾濱醫科大學附屬第四醫院收治的疑似病毒性心肌炎患兒38 例，主要臨床表現為腹瀉、發熱、心悸及氣促，確診為病毒性心肌炎患兒30 例（觀察組）；另選取同期體檢健康兒童30 例作為對照組。對照組中男18 例，女12 例；年齡0～14 歲，平均年齡（7.5±1.6）歲。觀察組中男19例，女11例；年齡0～14歲，平均年齡（7.8±1.2）歲。兩組兒童性別（χ2=2.757）、年齡（t=1.663）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第四醫院醫學倫理委員會審核批準，所有兒童監護人對本研究知情并自愿簽署知情同意書。

1.3 病毒性心肌炎診斷標準［4］血清柯薩奇病毒（CVB）RNA 陽性并符合下列輔助檢查改變之一：（1）存在心功能不全的臨床癥狀；（2）超聲心動圖檢查結果示心臟擴大、室壁運動彌漫性降低；（3）心電圖檢查結果示以R 波為主的≥2 個主要導聯ST-T 段改變，竇房和房室傳導阻滯，完全性右/左束支阻滯，成聯律、多形、多源、成對或并行性期前收縮，非房室結及房室折返引起的異位性心動過速，低電壓（新生兒除外）及異常Q波。

1.4 檢測方法

1.4.1 血液標本分離 （1）全血標本分離：采集抗凝血液標本后2 h 內輕搖混勻，使用RNase-free 吸頭吸取1 ml 全血標本至1.5 ml 離心管中，置于-70 ℃冰箱中保存待測。（2）血清標本分離：采集非抗凝血液標本后室溫下靜置20 min，血液凝固后5 000 r/min 離心10 min（離心半徑5 cm），使用RNase-free 吸頭吸取1 ml 血清至離心管中，置于-70 ℃冰箱中保存待測。

1.4.2 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR） 采用RT-qPCR 檢測外周血miRNA-216a 表達量，具體步驟如下：（1）將RNA 樣本置于冰塊上溶解，放置5X RT Buffer 和雙蒸水（DDH2O）（滅DNA 及RNA 酶）于室溫溶解（35 ℃）；（2）配制miRNA 反轉錄體系于1.5 ml EP 管中，輕彈EP 管使反轉錄體系徹底混勻，3 000 r/min 離心30 s（離心半徑5 cm），收集管壁殘余試劑并置于冰塊上；（3）準備miRNA 反轉錄反應液，輕彈miRNA 反轉錄反應液使其充分混勻，3 000 r/min離心30 s（離心半徑5 cm），將反應液置于PCR 儀上，37 ℃下孵育60 min，85 ℃環境下5 min 激活反轉錄酶后反應終止，將反應產物cDNA 置于-20 ℃冰箱中保存待測，qPCR 前將cDNA 稀釋為1/5 倍濃度；（4）溶解2X All-in-One qPCR Mix 及50X ROX Reference Dye，3 000 r/min 離心30 s（離心半徑5 cm）后置于冰塊上；（5）采用DDH2O 稀釋Universal Adaptor PCR Primer 至濃度為2 μM；（6）于冰塊上準備PCR 反應液；（7）混勻并短暫離心PCR 反應體系，使所有反應液處于PCR 管底部，并置于PCR 儀上進行反應。

1.4.3 電化學發光法 采用電化學發光法檢測血清心肌肌鈣蛋白I（cTnI）水平，具體步驟如下：取10 μl 血清加入50 μl 生物素標記的抗肌鈣蛋白I（TnI）單克隆抗體和50 μl 三聯吡啶釕標記的抗TnI 單克隆抗體，37 ℃下孵育9 min 后加入20 μ1 鏈霉素標記包被的微粒子，37 ℃下孵育9 min 后經電化學發光分析儀自動檢測；血清cTnI 水平參考范圍為0～0.09 μg/L。

1.4.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 采用ELISA 檢測血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，具體步驟如下：加入250 μ1 生物素標記的抗CK-MB 單克隆抗體，置于37 ℃水浴3 min，加入10 μl 待測血清混勻后置于37 ℃水浴10 min，加入50 μ1 三聯吡啶釕標記的抗CK-MB 單克隆抗體，5 min 內連續監測吸光度變化，由生化分析儀微電腦計算并輸出CK-MB 值；血清CK-MB水平參考范圍為0～24 U/L。

1.5 觀察指標 比較兩組兒童外周血miRNA-216a表達量及血清cTnI、CK-MB 水平，記錄觀察組患兒住院時間及急性生理學及慢性健康狀況評分系統Ⅱ（APACHE Ⅱ）評分。

手術并發癥情況:中毒性休克:觀察組無中毒性休克病例,對照組2例,切口感染:觀察組2例,對照組2例;觀察組中無腹腔感染患者,對照組4例,觀察組與對照組中均無腸梗阻患者,觀察組中無多器官功能衰竭患者。對照組中有1例多器官功能衰竭患者。對照組并發癥發生率為30%,觀察組并發癥發生率為6.67%。所有患者均經過6~12個月的隨訪,觀察組無復發病例。對照組中2例復發胃潰瘍,復發率為6.67%,組間差異具有統計學意義(P<0.05)。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件包進行數據處理，計量資料以（）表示，組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間、APACHE Ⅱ評分及血清cTnI、CK-MB 水平的相關性分析采用Pearson 相關分析；繪制受試者工作特征（ROC）曲線以評價外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平對小兒病毒性心肌炎的診斷價值，并計算曲線下面積（AUC），AUC 越大提示診斷價值越高。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB水平 觀察組患兒外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 相關性分析 觀察組患兒住院時間為（12.1±5.2）d，APACHE Ⅱ評分為（6.1±3.5）分。Pearson 相關分析結果顯示，外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間（r=0.409）、APACHE Ⅱ評分（r=0.607）及血清cTnI（r=0.491）、CK-MB（r=0.472）水平呈正相關（P＜0.05，見圖1）。

2.3 診斷價值 ROC 曲線顯示，外周血miRNA-216a表達量診斷小兒病毒性心肌炎的AUC 為0.662，血清cTnI 水平為0.705，血清CK-MB 水平為0.678，見表2、圖2。

表1 兩組兒童外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平比較（）Table 1 Comparison of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB between the two groups

表1 兩組兒童外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平比較（）Table 1 Comparison of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB between the two groups

注：miRNA-216a=微小RNA-216a，cTnI=心肌肌鈣蛋白I，CKMB=肌酸激酶同工酶

組別 例數 miRNA-216a（×104 copies/ml）cTnI（μg/L）CK-MB（U/L）對照組 30 0.91±0.05 0.09±0.03 7±2觀察組 30 2.34±0.89 0.35±0.07 20±4 t 值 8.787 18.699 16.143 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平對小兒病毒性心肌炎的診斷價值Table 2 Diagnostic value of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB in diagnosing viral myocarditis in children

3 討論

圖1 外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間、APACHE Ⅱ評分及血清cTnI、CK-MB 水平相關性的散點圖Figure 1 Scatter plot for correlations of peripheral blood miRNA-216a expression quantity with hospital stays，APACHE Ⅱ score，serum levels of cTnI and CK-MB in children with viral myocarditis

圖3 外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平診斷小兒病毒性心肌炎的ROC 曲線Figure 3 ROC curve for diagnostic value of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB in diagnosing viral myocarditis in children

小兒病毒性心肌炎的具體發病機制尚未完全明確，主要涉及自由基調節系統和免疫系統等［5］，且患兒病變病程、范圍及感染病毒類型不同則全身癥狀不同，多數患兒經積極治療可痊愈［6］。既往研究表明，病毒性心肌炎患兒病毒感染早期多無自覺癥狀，心電圖檢查顯示室性期前收縮、房性期前收縮、ST-T 段改變等，感染數周后心電圖檢查顯示正常或遺留心律失常［7］；輕癥自限型-病毒感染患兒感染1～3 周后出現心肌、輕微心前區不適癥狀，少數患兒出現心力衰竭和心臟擴大癥狀，治療后可逐漸恢復正常［8］；但部分急性重癥型-病毒感染患兒感染1～2 周后會出現心悸、胸痛、氣促等癥狀，并伴有奔馬律、心動過速、心力衰竭，嚴重者甚至出現心源性休克［6，9］。病毒性心肌炎患兒若得不到及時、有效治療則可能導致彌漫性心肌間質性炎性浸潤、心臟局造性炎性浸潤、心肌壞死、纖維蛋白溶解及心血管疾病等，且隨著患兒年齡增長，該疾病可成為患兒猝死的主要誘因之一［10］。因此，臨床應積極采取有效措施以減輕病毒性心肌炎患兒心肌損傷［5］。

miRNAs 為內源性非編碼RNA，可通過干擾信使RNA 而參與機體多種生理活動，并在多種疾病的發生、發展過程中發揮重要作用。miRNAs 廣泛存在于血液和組織中，循環系統中miRNAs 包被于脂蛋白或脂質內，因此不易被RNA 酶分解，可作為疾病的生物學標志物［11］。WANG 等［12］研究表明，許多miRNAs 在腎癌組織中表達異常，因此臨床可通過調控靶基因表達而發揮抑癌基因或癌基因的生物學作用。SHU 等［13］研究結果顯示，miRNA-216a 具有胰腺特異性，其在胰腺中的表達是其他組織中最高表達水平的數百倍。此外，miRNA-216a 還具有介導藥物、表觀遺傳學干預等治療作用，進而對心臟和心血管具有保護作用［14］。

cTnI 是心肌細胞中的特有收縮蛋白，在鈣離子參與下可調控收縮蛋白的舒縮活動，但心肌細胞膜完整時其無法透過細胞膜而進入血液循環，心肌細胞損傷后細胞膜完整性受損，cTnI 可從心肌細胞內釋放并進入血液循環，導致血清cTnI 水平升高并維持5～10 d［15］。因此，血液cTnI 水平可作為心肌細胞損傷的特異性標志物，有助于評估病毒性心肌炎患兒病情嚴重程度。CK-MB 主要分布于心肌，是臨床常用的心肌損傷特異及敏感性標志物，心肌損傷后2～12 h 血清CK-MB 水平急劇升高并維持2～3 d［16］，但其恢復正常的時間較快，因此診斷窗口期較短、漏診率較高。本研究結果顯示，觀察組患兒外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平高于對照組，提示病毒性心肌炎患兒存在心肌損傷；進一步行Pearson 相關分析結果顯示，外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間、APACHE Ⅱ評分及血清cTnI、CK-MB 水平呈正相關，提示外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒病情嚴重程度及心肌損傷程度有關。本研究結果還顯示，外周血miRNA-216a 表達量診斷小兒病毒性心肌炎的AUC 為0.662，血清cTnI 水平為0.705，血清CK-MB 水平為0.678，提示外周血miRNA-216a 表達量對小兒病毒性心肌炎的診斷價值與血清cTnI、CK-MB 水平相似。

綜上所述，外周血miRNA-216a 表達量與小兒病毒性心肌炎及其病情嚴重程度、心肌損傷程度有關，且其對小兒病毒性心肌炎的診斷價值與血清cTnI、CK-MB水平相似；但本研究為單中心研究，且樣本量較小，結果結論有待擴大樣本量、聯合多中心進一步證實。

作者貢獻：施帥進行文章的構思與設計，負責撰寫論文；孫超宇進行研究的實施與可行性分析，對文章整體負責，監督管理；趙佳進行數據收集、整理、分析，結果分析與解釋；白曉鵬進行論文的修訂；李學奇負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。