徂徠山病死松樹中線蟲的分離及鑒定

高 鋒，趙 濤，陳海燕，王怡霖，劉會香

（1.山東泰安市徂徠山林場，山東泰安271027； 2.山東農(nóng)業(yè)大學植保學院，山東泰安271000）

徂徠山地處魯中山區(qū)的中心位置，植被覆蓋率達到了87.8%,具有重要的生態(tài)價值[1]。 松林面積達4400hm2，主要樹種有油松、赤松、黑松。 目前徂徠山未發(fā)生松材線蟲病，但隨著松材線蟲病的不斷擴散蔓延，傳入徂徠山的風險不斷增加，為確保徂徠山松林資源安全，每年定期開展松材線蟲病的普查和抽樣檢測工作，為探究徂徠山松樹死亡原因，是否與松材線蟲或擬松材線蟲有關(guān)系，本研究調(diào)查了徂徠山10 個林區(qū)，采集了969 個樣品，從形態(tài)學、分子生物學等方面對所分離到的線蟲進行分析和評價。

擬松材線蟲( Bursaphelenchus mucronatus) 屬傘滑刃屬， 在形態(tài)上與引起松樹萎蔫病( Pine Wild Disease) 的松材線蟲（B.xylophilus）極其相似。 早期研究認為，擬松材線蟲致病力弱，在松樹受到惡劣環(huán)境的影響或者松樹被其他有害因子危害造成樹勢衰弱時，才會加速松樹枯死[2-4]。 近年來，我國部分非松材線蟲病發(fā)生區(qū)域也出現(xiàn)了大面積松林死亡，但是在死樹中并沒檢測到松材線蟲，卻發(fā)現(xiàn)擬松材線蟲[5-6]。 說明擬松材線蟲對一些松樹有較強致病性。 現(xiàn)有研究表明，擬松材線蟲致病性存在三類分化：第一類是強致病力，致死率大于85%；第二類是微弱致病力和潛在致病力，在環(huán)境適宜條件下能夠造成比較嚴重危害；第三類是無致病力[7-8]。 相比松材線蟲而言，擬松材線蟲分布更為廣泛，徐紅梅等研究發(fā)現(xiàn)， 在某些地區(qū)經(jīng)常是擬松材線蟲先出現(xiàn)，之后才有松材線蟲出現(xiàn)[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

2016-2018年定期在山東省泰安市徂徠山林場10 個林區(qū)，采集瀕死木，刮除外皮后取木質(zhì)部碎片，共采集969 個松樹樣本，帶回室內(nèi)進行檢測。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測

采用貝爾曼漏斗法。 吸取收集到的液體50μL，顯微鏡觀察是否有線蟲及特征。

1.2.2 線蟲鑒定

使用毛細管，挑取一定數(shù)量待檢線蟲在顯微鏡下觀察其形態(tài)，觀察線蟲的大小和形態(tài)。 分子鑒定參照趙立榮（2005）所使用的線蟲通用引物和松材線蟲和擬松材線蟲特異性引物[10]，然后挑取單條線蟲，置于PCR 管中，先液氮浴中1 min，然后85℃水浴2min， 重復該步驟兩次。 后加入蛋白酶K 2μL，56℃處理15 min 和95℃處理10min。 選用Taq MIX酶進行PCR 擴增，產(chǎn)物送至北京華大公司測序。 將測定的菌株序列提交到NCBI 上進行BLAST 比對，確定菌株的分類地位。

使用MEGA6 軟件進行系統(tǒng)進化分析， 采用Neighbor joining method。 參比序列及GenBank 分類號為：Bursaphelenchus mucronatus （KF025318.1 、JQ729986.1、JQ729987.1、JF751070.1、JF317235.1、EF446953.1、EU296624.1、AM400247.1、AM400246.1、AY347916.1、AY347915.1、AY347914.1、JQ729985.1、MH923204.1）；Bursaphelenchus xylophilus（MH173065.1、MH173064.1、MH173062.1、MH173061.1、MH173060.1、MH172328.1、MH172326.1 、MH172325.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離線蟲的鑒定

2.1.1 形態(tài)學特性

顯微觀察表明，徂徠山松木里面的線蟲主要有兩種，一種線蟲雌蟲尾部呈圓椎形，尾端指狀，有明顯的尾尖突，尾尖突長度約為3.80-5.71μm（圖1）。角質(zhì)層薄，上面布滿圓形小環(huán)；唇區(qū)高，縊縮明顯；口針基部增大；細長的食道腺覆蓋于腸道上方，長度約為4 個體寬；神經(jīng)環(huán)緊接在中食道球后方。 初步鑒定了擬松材線蟲（圖2）；另一類線蟲為口針退化，尾尖突細長，為腐生線蟲（圖3）

圖1 擬松材線蟲尾尖突

圖2 擬松材線蟲的口針及中食道球

圖3 腐生性線蟲形態(tài)特征

2.1.2 分子鑒定

圖4 PCR 擴增的結(jié)果，M 為DM5000 maker，1、2 為擬松材線蟲

對多批次的線蟲樣品進行總DNA 提取， 按照松材線蟲和擬松材線蟲的特異引物進行PCR 擴增，其PCR 產(chǎn)物大小約為250bp （圖4） 產(chǎn)物序列測定和 Blast 分析對比。 其均為擬松材線蟲（Bursaphelenchus mucronatus）。 基于ITS 序列的聚類分析也表明它們與擬松材線蟲聚在一起（圖5）。綜合形態(tài)學與分子生物學特征，確認送檢的線蟲均為擬松材線蟲。

圖5 所檢測樣品ITS 的NJ 系統(tǒng)進化分析

2.2 松木樣品檢測

徂徠山各林區(qū)松木樣品送檢檢測結(jié)果見表1。

通過表1 可以看出， 徂徠山的10 個林區(qū)均發(fā)現(xiàn)了死亡的松樹，其中茶石峪林區(qū)和徂徠林區(qū)所發(fā)現(xiàn)的死亡松樹最多， 太平頂景區(qū)和上池植物園最少。 所發(fā)現(xiàn)死亡松樹的主要樹種為赤松， 占比達88.5%，其次為黑松占比為11.5%。 在所有死亡的松樹樣品中，存在大量藍變現(xiàn)象，藍變率為73.1%，樣品中檢測到了大量線蟲，線蟲的檢出率為63.2%，其中擬松材線蟲檢出率為54.5%， 腐生性線蟲檢出率為8.7%；在不同樹種的樣品中，58.0%的赤松樣品中檢測到了擬松材線蟲，27.0%的黑松樣品中檢測到了擬松材線蟲， 說明赤松對擬松材線蟲對更為敏感。

3 結(jié)論與討論

3.1 本研究調(diào)查了徂徠山10 個林區(qū)， 采集了969個樣品，從線蟲形態(tài)學、分子序列測定方面進行了鑒定和測定。 研究顯示，在徂徠山衰弱、病死木中發(fā)現(xiàn)了大量的擬松材線蟲（Bursaphelenchus mucrona-tus）和腐生性線蟲。

表1 徂徠山不同林區(qū)松木樣品檢測結(jié)果

3.2 此前的報道中，擬松材線蟲對赤松（Pinus densiflora Sieb. et Zucc）、黃山松（Pinustaiwanensis hayata）和黑松（P. thunbergiiparl）、云南松（P.yunnanensis faranch）、思茅松（P. kesiya royle ex gordon var.langbianen）和高山松（P.densata）等的危害均有報道，常導致很多松林被毀[11-14]。 之前的一些報道中將擬松材線蟲的致病力分為3 種:致病力很強,致死率大于85%的種群、較強的致病潛能的,在環(huán)境適宜的情況下可能造成嚴重危害的種群和幾乎沒有致病力的種群[7-8]。 徂徠山10 個林區(qū)松樹死亡情況存在差異，茶石峪林區(qū)林區(qū)和徂徠林區(qū)所發(fā)現(xiàn)的衰弱和死亡松樹最多， 太平頂景區(qū)和上池植物園最少，赤松死亡現(xiàn)象嚴重，占到了總調(diào)查數(shù)量的88.5%，黑松次之，黑松僅占到了11.5%，赤松上藍變現(xiàn)象明顯，擬松材線蟲數(shù)量大，而黑松藍變現(xiàn)象不明顯，擬松材線蟲數(shù)量少，說明徂徠山松樹上的擬松材線蟲與松樹品種關(guān)系密切，是赤松死亡的主要原因，而黑松死亡可能與其它因素有關(guān)。

3.3 藍變菌是指那些能把樹木木質(zhì)部染成藍色或者藍黑色的真菌類群，大多數(shù)藍變菌都屬于長嚎殼類真菌。 有相關(guān)的研究表明，藍變菌和松材線蟲一起隨媒介昆蟲侵入健康的松樹體內(nèi), 感病松樹出現(xiàn)異常后,藍變菌會在樹干中從上向下擴散。木材有無藍變現(xiàn)象也是判斷松木是否感染松材線蟲的一個重要指標。同時藍變菌是松材線蟲最好的食物,對松材線蟲的快速繁殖起一定作用[15]。 本試驗采集了大量的松木樣品，發(fā)現(xiàn)了大量的藍變的松木，但是在藍變的松木中卻并沒有檢測到松材線蟲。 藍變的松木樣品中檢測到了擬松材線蟲，說明藍變菌也與擬松材線蟲有著密切的關(guān)聯(lián)，它們之間的關(guān)系還有待下一步探究。 另外在線蟲檢測中還發(fā)現(xiàn)有死亡松樹木材中有變紅現(xiàn)象，具體由哪一類病原引起有待進一步研究。