SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擬南芥葉片實驗教學的改進

王琳 劉杰 黃金林 潘志明

摘要：目的：改進擬南芥葉片的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離方法。方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擬南芥葉片。主要比較和分析了兩種樣品溶解液和兩種染色方法對實驗的影響。改進的樣品溶解液可防止樣品的損失，節約樣品和試劑；改進的染色方法操作時間短，靈敏度高，分離條帶多且清晰。結論：改進的實驗方法可以得到更為靈敏、清晰的實驗結果，同時節約了實驗經費和實驗時間，減少了實驗準備人員的工作量，更好地適應和促進了實驗教學工作。

關鍵詞：實驗教學；改進；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；葉片

中圖分類號：Q503 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2019）30-0266-02

目前，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳已成為蛋白質分析過程中所普遍采用的方法[1-3]。它具有結果直觀、分辨率較高、信息量大，技術成熟等優點，因此，此實驗也成為本科生生物化學實驗中的基礎性實驗，是生物化學實驗教學的重要內容。

一、方法

1.擬南芥葉片蛋白提取。用液氮研磨適量擬南芥葉片，加入蛋白提取緩沖液，渦旋震蕩15秒后，4℃，6000g離心30分鐘，收集上清，并用丙酮沉淀，即為葉片蛋白。將蛋白質樣品1mg左右，按1.0—1.5 g/L溶液比例，向樣品加入“樣品溶解液”溶解后，在100℃沸水浴中保溫2—3分鐘，取出冷至室溫。

2.電泳。先制備分離膠，再制備濃縮膠，輕輕將“梳子”插入濃縮膠內。凝膠聚合后，小心拔去“梳子”。將電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應沒過短玻璃片。用微量注射器在樣品凹槽內加樣，加樣體積為10μl。將上槽接負極，下槽接正極，打開電源，開始時將電流控制在15—20 mA，待樣品進入分離膠后，改為30—50mA。待藍色染料遷移至下端約1—1.5cm時，停止電泳。將凝膠片取出，滑入一培養皿內，加固定液固定后，加入染色液，染色完畢，加入脫色液，直至背景清晰。

3.實驗方法的改進。（1）樣品溶解液的改進。原蛋白質樣品溶解液：SDS 100 mg，巰基乙醇0.1 ml，甘油0.7 ml，溴酚藍2 mg，Tris-HCl緩沖溶液2ml，加蒸餾水至總體積10 ml。改進的蛋白質樣品溶解液：SDS 100 mg，巰基乙醇0.1 ml，甘油1.0 ml，溴酚藍2 mg，Tris-HCl緩沖溶液2 ml，加蒸餾水至總體積10 ml。（2）染色方法的改進。原染色方法：常規CBB R-250染色。將凝膠浸泡在固定液中3—4 h，然后在CBB R-250染色液（45%乙醇，10%乙酸，0.1%CBB R-250）中染色過夜，用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液（無R-250的染色液）脫色，20min/次，至背景顏色淺淡，蛋白質條帶清晰即可。改進的染色方法：藍銀染色。將凝膠浸泡于固定液中固定30min，以雙蒸水洗4次，每次15min，然后在染色液（0.12% CBB G-250，10% 硫酸銨，10% 磷酸和20%甲醇）中染色3—4 h，用蒸餾水漂洗數次直至背景顏色淺淡，蛋白質條帶清晰即可。

二、結果與分析

1.原樣品溶解液配制方法與改進的樣品溶解液配制方法的分離效果比較。由于原來的甘油濃度使樣品沉積效果不好，因此增加了甘油的濃度。這樣樣品會盡可能多地進入凝膠。圖1（a）為原溶解液法和原染色方法分離的擬南芥葉片PAGDE圖譜，圖1（b）為改進的溶解液法和改進的染色方法分離的擬南芥葉片PAGDE圖譜。從圖1中可以看出，原方法分離的蛋白條帶顯現較少，大多數低峰度蛋白條帶無法顯現（圖1a）。改進的方法分離蛋白的條帶較多，背景清晰，圖1（a）中清晰的蛋白條帶在圖1（b）中進一步加深，有些圖1（a）中檢測不到的條帶在圖1（b）中檢測到了（圖1b），因此，改進的方法靈敏度更高，更節約時間，分離效果更好，更適合SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擬南芥葉片的實驗教學。

三、討論

樣品裂解液既要盡可能充分地溶解蛋白樣品，也要保證溶解的蛋白樣品能盡可能進入到電泳體系中。甘油可以協助沉淀蛋白質。改進后的樣品溶解液提高了甘油的比例，這樣使得溶解的蛋白樣品能盡可能全部進入到電泳體系中，從而間接增加了蛋白樣品的上樣量，節約了蛋白樣品的用量，而且還同時可以得到較好的蛋白分離效果。染色方法是影響實驗分離效果的一個關鍵的環節，它影響了實驗的顯像結果。目前大多數實驗用的常規的染色方法仍是考染。迄今還未見有將經典考染和藍銀染色這兩種方法用于常規實驗比較的報道。通過本實驗的研究發現藍銀染色的靈敏度要高于經典考染（圖1）。電泳中常規的染脫色法以考馬斯藍、乙酸和水作為染色和脫色劑，所需時間冗長，不便于凝膠成像。改進的染色法中甲醇可以更好地把蛋白質固定在凝膠中。磷酸既可以維持染液的酸度，又有利于蛋白質與考馬斯亮藍的結合。硫酸銨使得蛋白染色靈敏度得以提高。因此改進的染色方法更有利于獲得條帶數量多、背景清楚、靈敏度高的凝膠圖像。這些實驗方法的改進對實驗教學工作產生了很大的影響。如：（1）可以節約實驗成本。改進的實驗方法比原實驗方法可以更好地防止樣品的損失，從而節約了樣品。改進的實驗方法比原實驗方法少用3%的甘油，節約了試劑。這些都更好地節約了實驗成本。（2）可以節約實驗時間。原染色方法染色時間較長（需過夜），脫色時間也較長。這不僅浪費試劑，而且也造成時間的浪費。改進的染色方法染色時間較短（3—4h），脫色時間也較短。所用試劑較少（脫色液只用蒸餾水），這既節約試劑，減少了試劑的污染，而且也節約了寶貴的時間，能讓學生在規定的實驗時間內得到理想的結果。（3）減少了實驗準備人員的工作量。如今實驗準備人員緊缺，這更大地發揮了實驗工作人員的價值。

四、結論

本實驗方法彌補了SDS聚丙烯酰胺凝膠分離擬南芥葉片蛋白傳統方法的一些不足，如用改進的樣品溶解液代替原溶解液；用改進的藍銀染色方法代替原考馬斯亮藍染色方法。這些對實驗的改進得到了更為靈敏、清晰的實驗結果，同時節約了實驗經費和實驗時間，能讓學生在規定的實驗時間內得到理想的結果。同時也減少了試劑污染和實驗準備人員的工作量，更好地適應和促進實驗教學工作，也有利于其他老師從中得到啟發。

參考文獻：

[1]崔雪瑩，相美容，武皓.薏苡仁蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析[J].山東中醫雜志，2017，（2）：155-157.

[2]王芳，李曉靜，周延清，等.聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測大豆SRAP標記[J].中州大學學報，2014，（6）：125-128.

[3]張延紅，高素芳，陳紅剛，等.甘草種子蛋白質提取及SDS-PAGE電泳技術研究[J].種子，2016，35（2）：21-24.