柴枳半夏湯加減對結核性胸膜炎治療前后胸膜厚度及炎癥因子的影響

潘靜潔 黃晉 劉堂營

廣州市胸科醫院中醫科（廣州510095）

結核性胸膜炎（tuberculous pleuritis）屬于肺外結核病，是結核桿菌及其自溶產物或代謝產物首次侵入機體的胸腔膜所引起的胸膜炎癥，2000年已經被我國衛生部批準的新分類法歸納為結核病的第四類型［1-2］。一般在臨床上，結核性胸膜炎容易導致炎癥細胞浸潤，從而促使血管通透性增高，隨后發生纖維化、漿液滲出增加進而引起胸水，然后胸腔積液會在不同的細胞因子刺激下，進一步引發肺纖維化，最終嚴重影響肺組織的正常功能，引起胸膜炎的臨床癥狀［2-4］。《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》：“飲后水流在脅下，咳唾引痛，謂之懸飲。”證見脅下脹滿，咳嗽或唾涎時兩脅引痛，甚則轉身及呼吸均牽引作痛，心下痞硬脹滿，或兼干嘔、短氣，頭痛目眩，或胸背掣痛不得息，因此在中醫的理論劃分中，結核性胸膜炎屬于“懸飲”范疇［5］。而柴枳半夏湯出自《醫學入門》，能和解少陽，清熱宣肺，柴胡、黃芩和解少陽，瓜蔞、半夏、枳殼寬胸祛痰利氣，青皮、赤芍理氣止痛，桔梗、杏仁宣肺止咳，對懸飲初期出現的胸脅悶痛等具有良好的臨床療效，其中柴胡、枳殼、桔梗也被廣泛認為具有良好的抗纖維作用［6-7］。柴枳半夏湯還能調暢中焦氣機，《難經·二十二難》曰：“氣主呴之，血主濡之”。氣行則血行，治血先治氣。而近年來，越來越多研究發現，胸腔積液中有許多成分，其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）與胸膜厚度和炎癥反應的變化具有密切關系［7-9］，轉化生長因子-β1（TGF-β1）則是纖維化過程中非常關鍵的細胞因子［10］。因此，基于我院科室利用柴枳半夏湯加減聯合抗結核藥及胸腔穿刺引流術治療結核性胸膜炎取得良好療效的臨床基礎上，觀察治療前后胸膜厚度、胸腔積液消失時間以及采用RT-PCR檢測胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ mRNA水平的變化，以期揭示柴枳半夏湯加減治療結核性胸膜炎的作用機制，為柴枳半夏湯的臨床應用提供一定的科學理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2018年3月1日至2019年2月28日在我科住院接受診治的結核性胸膜炎病人80例，按照隨機數字法隨機分為聯合組和對照組，每組40例。本研究中所有患者均已簽署我院的知情同意書，患者本人及其家屬均對研究的方法和臨床意義知情并且同意配合開展，且本研究已獲得我院倫理委員會的批準同意。其中聯合組中男22例，女18例，平均年齡為（54.6±19.1）歲，病程（25.4±5.2）d，體質量指數（BMI）為（22.9±2.2）kg/m2，而對照組中男 19例，女21例，平均年齡為（50.3±18.5）歲，病程（29.3±7.5）d，BMI為（23.2±2.8）kg/m2，經統計分析后發現，兩組患者在性別比、BMI、病程長短和年齡等一般資料相比差異并無統計學意義（P＞0.05），資料具有可比性。

1.2診斷標準按照2017版《WS288-2017肺結核診斷》中對于結核性胸膜炎的診斷標準制定。（1）臨床診斷：PPD試驗呈現陽性者（硬結平均直徑≥10 mm）；IGRAS檢測陽性結果；結核抗體陽性者；影像所見為滲出性胸腔積液，表現為少量或中大量的游離積液，或存在于胸腔任何部位的局限積液，胸水常規、生化表現為滲出液。（2）確診病例：涂片顯微鏡檢查陽性；分枝桿菌培養陽性，鑒定為結核分枝桿菌復合群；結核分枝桿菌核酸檢測陽性；胸腔積液或胸膜病理學檢查表現為上皮細胞樣肉芽腫性炎，顯微鏡下可見壞死性和非壞死性肉芽腫，PCR檢測陽性。

1.3納入標準及排除標準納入標準：同時符合診斷標準和剔除標準的患者。排除標準：（1）年齡＞75歲或＜18歲的患者；（2）其他疾病原因引起胸腔積液的患者；（3）近期曾進行抗結核治療的患者；（4）合并嚴重臟器功能衰竭不宜服用中藥的患者；（5）主客觀不配合治療的患者；（6）未簽署知情同意書的患者。

1.4治療方法對照組：入院后常規胸部彩色多普勒超聲檢查及胸腔積液定位，鹽酸利多卡因（國藥準字H37022839，山東華魯制藥有限公司）局部浸潤麻醉，胸腔穿刺引出胸水進行檢查，首日引出量≤600 mL，以后每日引出量≤1 000 mL，直至胸水完全吸收。確診結核性胸膜炎后，給予常規抗結核方案2HRZE/4HR治療，對年輕患者在急性期加用醋酸潑尼松片30 mg/次（國藥準字H44020682，廣東華南藥業集團有限公司），1次/d，逐漸減量，療程8周，對有浸潤性結核灶、有糖尿病史者和老年人暫緩使用。強化期2～3個月，總療程6個月以上。

聯合組：在對照組治療基礎上給予柴枳半夏湯治療，每日1劑，水煎至400 mL，早晚兩次分服，療程8周，柴枳半夏湯加減：柴胡12 g，黃芩12 g，四花青皮10 g，枳殼10 g，姜水半夏10 g，桔梗10 g，瓜蔞皮15 g，赤芍10 g，桑根白皮10 g，甘草5 g，加減：咳嗽劇烈、肋痛加白芥子10 g，干嘔腹脹加黃連5 g，持續高熱加麻杏石甘湯（本研究所用到的中藥飲片均采購自康美藥業股份有限公司）。

1.5療效評價（1）按照《中醫病證診斷療效標準》中《懸飲》療效標準進行評定，治愈：臨床癥狀消失，胸水吸收，實驗檢查正常。好轉：癥狀好轉，胸水減少。未愈：癥狀、胸水均未改善。（2）采用B超測量胸膜厚度及判斷胸腔積液消失時間，記錄治療前后的胸膜厚度（取3個不同的部位測量然后取平均值），胸腔積液消失時間為初次檢查時間至復查未見積液時間。（3）記錄治療前后胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ mRNA水平的變化，RT-PCR檢測：取胸水5 mL，加入適量Trizol試劑，根據說明書提取總RNA，然后使用PrimeScript RT試劑盒從等量的RNA獲得cDNA，然后再使用ABI 7500和SYBR Premix ExTaqⅡ進行RT-qPCR。β-actin作為mRNA的定量對照。引物序列如下：TGF-β1 sense：5′-GTGGAAAGCGGCAACCAA-3′，TGF-β1 antisense：5′-GCCCGAGAGAGCAATACAGG-3′；TNF-α sense：5′-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGA-3′，TNF-α antisense：5′-GGAAGACCCCTCCCAGATAGA-3′；IFN-γ sense：5′-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3′，IFN-γ antisense：5′-TTCGACTGATTAATAAGC-3′；β -actin sense：5′-TTCCTGGGCATGGAGTCCT-3′；β-actin antiense：5′-TGATCTTCATTGTGCTGGGTG-3′。

1.6統計學方法采用SPSS 19.0專業統計學軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，組間以及治療前后的比較采用兩獨立樣本配對t檢驗進行統計分析；計數資料（臨床療效）的比較采用Fisher確切概率法進行統計分析，其中P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1不同組患者臨床療效比較按照療效標準評定后發現，聯合組中治愈的患者有20例，而好轉的患者有16例，其臨床有效率（90.0%）明顯高于對照組（67.5%），經統計分析后顯示兩組患者臨床療效組間的差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同組患者臨床療效對比Tab.1 Comparison of clinical efficacy of different groups of patients 例

2.2不同組患者胸腔積液消失時間以及治療前后胸膜厚度變化經過治療后發現，對照組患者胸腔積液消失時間為（16.84±2.97）d，明顯長于聯合組（12.57±3.10）d，其組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。此外，兩組患者治療前胸膜厚度的差異并沒有統計學意義（P＞0.05），但是，治療8周后聯合組患者胸膜厚度小于對照組，其組間差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3不同組患者治療前后TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的變化為了進一步探究柴枳半夏湯加減治療結核性胸膜炎的作用機制，本研究通過RTT-PCR檢測兩組患者治療前后胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達水平變化，結果顯示，治療前，兩組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達水平并差異沒有統計學意義（P＞0.05），但經過8周的治療后，兩組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達水平均發生了顯著下調，治療前后的表達水平下調倍數差異具有統計學意義（P＜0.05）；另外，與對照組相比，聯合組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達水平下調更為顯著，其組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

表2 不同組患者胸腔積液消失時間以及治療前后胸膜厚度變化Tab.2 The disappearance time of pleural effusion and the changes of pleural thickness before and after treatment in different groups（n=40）±s

表2 不同組患者胸腔積液消失時間以及治療前后胸膜厚度變化Tab.2 The disappearance time of pleural effusion and the changes of pleural thickness before and after treatment in different groups（n=40）±s

注：與治療前相比，*P＜0.05；與對照組相比，#P＜0.05

組別 胸腔積液消失時間（d）胸膜厚度（mm）治療前 治療8周對照組聯合組16.84±2.97 12.57±3.10#5.2±0.67 5.1±0.58 3.9±0.61*3.3±0.46*#

3 討論

結核分枝桿菌及其自溶產物或代謝產物引起的結核性胸膜炎是一種常見的內科疾病，隨著現代生活水平的提高，這種疾病的患者數量也越來越多［3，11］。目前，大部分結核性胸膜炎是急性病，主要表現為結核分支桿菌的全身中毒癥狀以及胸腔積液導致的局部癥狀。結核分支桿菌的全身中毒癥狀為發熱、畏寒、出汗、乏力、食欲不振等；胸腔內積液可以刺激胸膜，從而導致反射性干咳，當體位轉動時癥狀會更加明顯，而當積液量少時僅有胸悶、氣促等癥狀，一旦胸腔內存在大量積液，則會壓迫肺、心和縱隔，出現呼吸困難［12］。目前，對胸腔積液的患者，一般都會采用胸膜腔穿刺術來抽取積液達到治療效果，然后再結合抗結核方案對結核性胸膜炎進行治療。大量研究［11，13-14］表明，引起結核性胸膜炎的途徑主要有：（1）肺門淋巴結核的結核分枝桿菌經過淋巴管逆流到胸膜；（2）結核桿菌或其代謝產物直接進入到胸膜腔內；（3）急性血行播散性結核導致胸膜炎；（4）胸椎結核或肋骨結核向胸膜腔發生潰破導致胸膜炎等。現有的胸腔鏡活檢已經證實了大部分結核性胸膜炎壁層胸膜有明顯的結核病理改變，因此，結核性胸膜炎的主要發病機制是結核分枝桿菌直接遍及胸膜而導致的［12，15］。劉凌等［16］通過觀察比較結核性胸膜炎患者胸水和血清中INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的含量發現，當結核分枝桿菌及其自溶產物或代謝產物進入胸膜腔時，主要會引起細胞的免疫應答，刺激CD4+淋巴細胞活化增殖，分化為Th1和Th2細胞［17］，Th1細胞分泌的細胞因子主要是INF-γ、IL-2等，能夠增強巨噬細胞等免疫細胞直接殺死結核桿菌，結核病患者的Th1細胞介導的細胞免疫通常減弱，而傾向激活Th2細胞，Th2分泌的多種細胞因子如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等也一定程度上可以抑制Th1細胞的免疫應答，減少Th1型細胞因子生成，降低巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞吞噬結核桿菌的能力，從而削弱了保護性免疫應答，這種Th1/Th2細胞的比例失調，容易導致嚴重的全身性感染，或形成空洞，排菌等［18-20］。另外，處于增殖周期的單核-巨噬細胞和T淋巴細胞還會釋放大量的IL-2、TNF-α和IFN-γ，導致結核性胸膜炎患者胸水中細胞因子的活性增強［21］。還有研究［8-9］發現，TNF-α和IFN-γ與胸膜厚度、炎癥反應的變化密切相關，可見在結核性胸膜炎的臨床評價中，TNF-α和IFN-γ的含量變化可以直接反映藥物的療效。近年來，新的CD4+淋巴細胞亞型，Th3細胞被關注，Th3可能從Th0細胞分化而來，Th3細胞能調節并抑制免疫細胞的增殖、分化及細胞因子的分泌，Th3細胞能分泌TGF-β1，而TGF-β1也能誘導產生Th3，Th3細胞比例與TGF-β1表達水平呈正相關［22-23］。已有研究［24-26］證實，TGF-β1可以通過Smads依賴性信號通路、非Smads依賴性信號通路，以及其他轉錄相關通路參與到上皮間質轉化（EMT）、細胞外基質mRNA轉錄、胸膜血管新生等過程中。因此，本研究將TGF-β1、TNF-α和IFN-γ，以及胸膜厚度、胸腔積液消失時間作為主要的觀察指標來評價藥物的臨床療效。

圖1 兩組患者治療前后胸水中TGF-β1（A）、TNF-α（B）和IFN-γ（C）mRNA的表達水平Fig.1 The mRNA expression level of TGF-β1（A），TNF-α（B）and IFN-γ（C）in pleural effusion before and after treatment in two groups

目前，已有報道中藥湯劑能使降低患者胸水及血清TGF-β1水平，減少胸水產生，降低胸膜增厚粘連發生率［6-7，27］。張偉等［28］通過觀察活血化瘀法聯合常規治療對結核性胸膜炎患者胸膜厚度和纖維蛋白原（FIB）的含量變化，發現活血化瘀類中藥能夠有效降低胸膜的厚度，抑制患者胸水中纖維蛋白原的表達，從而改善疾病的預后情況［29］。《柴枳半夏湯》出自《醫學入門》，能和解少陽，清熱宣肺，柴胡、黃芩和解少陽，瓜蔞、半夏、枳殼寬胸祛痰利氣，青皮、赤芍理氣止痛，桔梗、杏仁宣肺止咳，對懸飲初期出現的胸脅悶痛等具有良好的臨床療效。其中柴胡、枳殼、桔梗也被廣泛認為具有良好的抗纖維作用［6，30-31］。因此，基于我科在臨床上應用柴枳半夏湯加減結合抗結核藥及胸腔穿刺引流術治療結核性胸膜炎取得良好療效的基礎上，采用RT-PCR檢測兩組患者治療前后胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平的變化以及胸膜厚度、胸腔積液消失時間等，對兩組患者治療前后臨床療效進行評價，研究發現，兩組患者治療后，聯合組的臨床有效率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組患者胸腔積液消失時間明顯長于聯合組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；聯合組患者胸膜厚度明顯小于對照組（P＜0.05），表明柴枳半夏湯加減結合抗結核藥及胸腔穿刺引流術能夠有效縮短胸腔積液消失的時間和減輕患者胸膜增厚的程度。為了進一步探究柴枳半夏湯治療結核性胸膜炎的作用機制，通過RT-PCR檢測發現，治療后，兩組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的水平發生明顯下調，治療前后的差異有統計學意義（P＜0.05），并且組間比較，差異同樣具有統計學意義（P＜0.05），這表明柴枳半夏湯加減結合抗結核藥及胸腔穿刺引流術很可能是通過抑制TGF-β1、TNF-α和IFN-γ的基因表達，從而激活機體的免疫反應，促進巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞吞噬結核桿菌，并抑制肺組織纖維化的過程，減輕結核性胸膜炎患者胸膜的增厚程度和加快胸腔積液的消失，最終發揮治療作用。

綜上所述，柴枳半夏湯加減結合胸腔穿刺加常規抗結核治療，比單純胸腔穿刺加抗結核治療對結核性胸膜炎更加有效，可能是與聯合治療方法能夠抑制TNF-α和IFN-γ的表達，調節機體的免疫反應，抑制炎癥反應，進而減輕胸膜增厚有關。另外，柴枳半夏湯加減還能夠調節機體氣機，降低TGF-β1的表達水平，從而抑制纖維化的程度和纖維蛋白的表達，從而改善結核性胸膜炎患者的臨床癥狀，提高療效。然而，目前針對中醫藥方劑結合西藥治療結核性胸膜炎的研究不多，因此，后續需要擴大樣本量，進一步研究中醫藥結合西藥治療懸飲其他辨證分型的療效，并深入探討中西醫結合治療結核性胸膜炎的信號通路和作用機制，以期提供更加完善的科學依據，為臨床上應用柴枳半夏湯治療結核性胸膜炎奠定扎實的理論基礎。