應用磁共振體素內不相干運動成像評價大鼠肝纖維化

王琳萍，裴彩俠，劉釗，劉海峰，張鵬飛，田瑜，鄭雅蘭，王少彧，雷軍強*

肝纖維化是各因素導致大量膠原和蛋白多糖等細胞外基質的過度沉積，研究證實早期(F2期以前)肝纖維化可以通過臨床干預實現逆轉[1]，肝穿活檢是其診斷金標準，但不能反映肝臟的全部病理改變；目前超聲瞬時彈性成像(transient elastography，TE)、磁共振彈性成像(magnetic resonance elastography，MRE)[2-3]、DWI是臨床評價肝纖維化主要影像檢查方法[4]，但在診斷早期肝纖維化方面存在局限性。較傳統的擴散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)成像主要依賴組織中水分子的布朗運動，在活體生物組織內水分子運動來自于兩個方面，包括真正的水分子擴散和微循環灌注所致的水分子擴散效應，ADC值包含了水分子擴散運動和微循環灌注兩種成分，并不能單純地代表活體組織內真正的水分子運動。體素內不相干運動(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像通過雙指數模型多b值數據擬合得到D、f和D*三個重要參數，其中D值代表體素內真實水分子擴散成分；D*和f是灌注相關參數，前者是偽擴散系數，表示組織內微循環灌注引起的假擴散效應，后者是灌注分數，即體素內偽擴散成分占總的水分子擴散成分的比例。故IVIM不僅能提示病灶內水分子的擴散受限程度，而且同時能夠評估血流變化情況。

本研究基于大鼠肝纖維化模型，探討IVIM雙指數模型參數D、D*及f值對肝纖維化診斷及分期的能力，并將其與ADC值對肝纖維化的診斷和分期效能進行比較，為肝纖維化的早期診斷提供動物實驗數據。

1 材料與方法

1.1 肝纖維化模型的制備

由蘭州大學動物中心選成年雄性SPF級SD大鼠[5](倫理委員會批件編號：LDYYLL2018-129) 66只，體重(200±10) g，健康狀況良好，隨機分為實驗組55只和對照組11只，每次注射前稱重以調整給藥劑量，實驗組0.3 mL/100g體重腹腔注射[6]40% CCl4橄欖油混合液，對照組注射生理鹽水，每周2次，共12周。

1.2 MRI掃描

從第二周開始每周六取實驗組(5只)和對照組(1只)共6只，0.7 ml/100 g體重腹腔注射0.5%戊巴比妥后將其以俯臥位頭先進固定于線圈(西門子3.0 T Skyro 掃描儀，大鼠專用線圈)中以減少運動偽影，進行如下掃描。

常規序列：Ax TSE-T1WI：TR 721 ms，TE 8.6 ms；SE-T2WI-FS：TR 3000 ms，TE 109 ms；FOV 100 mm×100 mm，層厚3 mm，間距0 mm，NEX為2；DWI：Ax SE-EPI，TR 5000 ms，TE 49 ms，FOV 180 mm×180 mm，層厚3 mm，間距0 mm，NEX為1，b值取0、800 s/mm2。IVIM序列：Ax SE-EPI：TR 6400 ms，TE 106 ms，FOV 200×200 mm，層厚3 mm，間距 0 mm，NEX為1，擴散敏感梯度方向數3，8個b值分別為0、50、150、200、400、600、800 s/mm2。

1.3 圖像處理與數據測量

使用Siemens Workstation后處理DWI序列得到ADC圖。多b值IVIM原始數據導入Start MITK Diffusion后處理軟件得到D、f和D*圖。為避免心臟及肝臟管道系統對圖像質量和各參數值的影響，分別在肝臟右后葉盡量靠近病理活檢部位的3個掃描層面上畫取3個位置、大小盡量保持一致的感興趣區(region of interest，ROI)(大小約 3～4 mm2)，對比參考常規T2序列圖像，求平均值。圖像處理與數據測量均由兩位影像醫師在未知病理結果的情況下獨立進行，遇分歧商議解決。

1.4 肝組織病理學檢查

所有MRI掃描后的大鼠均采用過量麻醉法處死，解剖取出肝組織固定、石蠟包埋切片，行HE染色。由2名資深病理醫師采用Metavir標準對大鼠肝纖維化分期[7]，進行雙盲法診斷。Metavir標準將纖維化分為F0～F4期：F0期，無纖維化；F1期，匯管區及其周圍纖維化和竇周少量纖維化；F2期，纖維間隔形成，但小葉結構基本未受到破壞；F3期，纖維間隔增多，破壞肝小葉結構，但無肝硬化；F4期，早期肝硬化。

表1 大鼠肝纖維化模型制備情況Tab. 1 Preparation of rat liver fibrosis model

1.5 數據統計處理

使用SPSS 22.0對DWI及IVIM數據進行統計分析，結果用x±s表示。通過Spearman檢驗分析DWI、IVIM各參數值與肝纖維化程度的相關性，采用獨立樣本t檢驗比較正常組與實驗組(肝纖維化)大鼠的參數值，使用單因素方差分析的LSD-t檢驗法對肝纖維化各期的DWI及IVIM參數值進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統計學意義。通過ROC曲線判斷各參數值，即臨界值(Cutoff值)、敏感度(Sen)(95%CI)、特異度(SPE)(95%CI)、陽性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)、Youden指數對各階段肝纖維化的鑒別診斷價值，并給出最佳參數閾值。

2 結果

2.1 大鼠肝纖維化模型結果

試驗期間對照組11只全部順利行MR掃描并納入研究分析；實驗組在建模期間4只死亡(第7、8周各1只，第10周2只)，6只掃描圖像質量不佳被排除(第2周2只，第4、5、11、12周各1只)，共45只納入研究分析(表1)。依據Metavir分級標準結果為：F1期8只，F2期13只，F3期14只，F4期10只，對照組11只為F0期。

圖1 肝纖維化F0～F4期(A，B) T2壓脂圖像。A：正常小鼠肝組織；B：F1期肝纖維化，肝臟形態規則，信號均勻，與正常大鼠無明顯差異；C：F2期肝纖維化，肝臟形態尚可，但內部血管走形僵硬，似可見結節樣變，T2信號略升高，可能與CCL4造成的損傷相關；D：F3期肝纖維化，與F2期無明顯差異；E：早期肝硬化，肝組織結節樣變不明顯，與早期肝纖維化表現相似 圖2 肝纖維化F3(A，B)期IVIM序列圖像。A：F3期肝纖維化大鼠IVIM融合圖；B：體素內真性水分子擴散D圖，D值為1.13×10-3 mm2/s；C：灌注分數f圖，f值為0.17；D：體素內微循環灌注D*圖，D*值為35.27×10-3 mm2/sFig. 1 F0—F4 phase (A, B) T2 liposuction image of liver fibrosis. A: normal mouse liver tissue. B: Picture, F1 stage liver fibrosis, liver shape regular, uniform signal, no signi ficant difference with normal rats. C: F2 stage liver if brosis, liver morphology is acceptable, but internal blood vessels Stiff-shaped, seemingly nodular changes, T2 signal slightly elevated, may be related to the damage caused by CCL4. D: F3 liver fibrosis, no signi ficant difference with F2. E: early liver cirrhosis, nodular change of liver tissue is not obvious were not obvious and were similar to early liver fibrosis. Fig. 2 Image of the IVIM sequence of liver fibrosis F4 (A, B). A: IVIM fusion map of F3 liver fibrosis rats. B: The D map of the true water molecule diffusion in the voxel, the D value is 1.13×10－3 mm2/s. C: The perfusion fraction f map, the f value is 0.17. D: Intra-microcirculation perfusion D* map, D* value is 35.27×10-3 mm2/s.

圖3 A：DWI、IVIM各參數鑒別肝纖維化F0和F1～F4的ROC曲線；B：DWI、IVIM各參數鑒別肝纖維化F0～F1和F2～F4的ROC曲線；C：DWI、IVIM各參數鑒別肝纖維化F0～F2和F3～F4的ROC曲線；D：DWI、IVIM各參數鑒別肝纖維化F0～F3和F4的ROC曲線Fig. 3 A: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0 and F1—F4 by DWI and IVIM parameters. B: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0—F1 and F2—F4 by DWI and IVIM parameters. C: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0—F2 and F3—F4 by DWI and IVIM parameters. D: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0—F3 and F4 by DWI and IVIM parameters.

2.2 T2WI壓脂及IVIM掃描圖像特點

正常肝臟在T2WI壓脂相上信號稍低，信號強度均勻一致，肝臟邊緣規整光滑，肝實質內未見異常信號結節影；肝纖維化肝臟信號較高，實質信號不均勻，肝臟邊緣不規整。隨肝纖維化進展，肝實質擴散受限明顯，IVIM圖像信號逐漸升高(圖1，2)。

表2 對照組與實驗組各參數值比較(x±s)Tab. 2 Comparison of values between the control group and the experimental group (x±s)

表3 對照組及實驗組各期肝纖維化各參數值對比(56只，x±s)Tab. 3 Comparison of parameters of liver fibrosis in control group and experimental group (n=56, x±s)

表4 肝纖維化與各參數的相關性Tab. 4 Correlation between liver fibrosis and various parameters

2.3. DWI與IVIM評價指標與統計學分析結果

2.3.1 對照組與實驗組DWI、IVIM各參數值對比

對照組和肝纖維化組的ADC值均高于其D值，P＜0.05。實驗組DWI、IVIM各參數均較對照組減低，差異均具有統計學意義，P＜0.05(表2)。

2.3.2 肝纖維化各期 DWI、IVIM各參數值比較

分析結果顯示隨肝纖維化水平增加，ADC、D、f及D*總體呈下降趨勢(表3)。在DWI單指數模型中，F3和F4期ADC值具有顯著差異(P＜0.05)，F0和F1、F1和F2、F2和F3之間ADC值無顯著差異。在IVIM雙指數模型中，正常大鼠與肝纖維化F1期大鼠的D*值有顯著差異(P＜0.05)；F1和F2期大鼠的D*和f值有顯著差異(P＜0.05)；F3和F4期大鼠的D值有明顯差異(P＜0.05)(表3)。

2.3.3 DWI、IVIM各參數值與肝纖維化程度的相關性

Spearman秩檢驗顯示ADC、D、f及D*值與肝纖維化嚴重程度呈負相關(r=-0.657，-0.668，-0.711，-0.851，P=0.01)(表4)。

2.3.4 DWI、IVIM各參數值診斷不同階段肝纖維化的準確性

由DWI、IVIM各參數評估肝纖維化的感受性曲線得出，D*值對F0和F1～F4期、F0～F1和F2～F4期及F0～F2和F3～F4期的鑒別效能均優于ADC、D和f值(表5；圖3A～C)；ADC在F0～F3和F4期的鑒別診斷上，ROC曲線下面積最大，具有較高的診斷效能(表5；圖3D)。

表5 DWI及IVIM各參數對不同階段肝纖維診斷準確性Tab. 5 Diagnostic accuracy of liver fiber in different stages of DWI and IVIM parameters

3 討論

慢性損傷導致的細胞外基質產生及降解的失衡是肝纖維化發展的主要機制，肝星狀細胞(HSCs)未受到刺激時處于未激活狀態，肝臟受損后，在炎癥、損傷、壞死等因素作用下肝臟實質和非實質細胞開始分泌各種細胞因子，同時肝星狀細胞激活為成纖維細胞和成肌纖維細胞，通過不斷增生和分泌細胞外基質而打破細胞外基質的代謝平衡，使膠原蛋白基質異常沉積于肝臟形成肝纖維化[8]。注射CCL4橄欖油混合液建立肝纖維化是經典的建模技術，較其他方法安全、穩定、高效，由于慢性肝炎活動與肝纖維化呈正相關，故利用一系列指標來區分慢性丙型肝炎活動程度的METAVIR分級可用于評價并量化肝纖維化[9]，幫助確定治療和檢測疾病的發展，其中F0～F4肝纖維化程度由輕到重。IVIM參數在不同程度肝纖維化間有差異，相對于ADC值，IVIM參數可反映組織的擴散和灌注情況，可更全面、準確地反映肝纖維化早期的病理生理改變。

3.1 ADC值及IVIM相關參數D值、f值、D*值評價大鼠肝纖維化的診斷價值

本研究實驗組ADC值、D值、f值及D*值均較對照組ADC值明顯降低，差異具有統計學意義，與部分研究的結論一致[10-12]，表明肝纖維化肝臟的水分子擴散和微循環灌注都受到限制。另外，本研究得出ADC值、D值、f值及D*值與肝纖維化水平呈負相關(r=-0.657，-0.668，-0.711，-0.851，P=0.001)，與Franca等[11]認為D值在正常肝臟與肝纖維化肝臟之間無顯著差異的結論不一致，可能與本研究樣本量較小有關。當肝纖維化程度進展，各參數值逐漸降低，其中ADC值和D值在肝纖維化晚期(F3期和F4期肝纖維化之間[13-14])差異具有統計學意義，D*值和f值在肝纖維化早期差異比較明顯，前者在正常肝臟和F1期肝纖維化之間及F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統計學意義，后者在F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統計學意義。ADC值的減低一方面是因為肝纖維化時隨著肝內膠原蛋白不斷積累，限制了水分子的自由擴散，引起ADC值減低；另一方面是由于肝纖維化，肝細胞腫脹、變性，竇腔狹窄變形，肝內門脈高壓，門靜脈血流減少，代償性增多的肝動脈血供不足以彌補門靜脈血循環的減少也導致肝纖維化肝臟ADC值降低[15]。D值代表體素內純的水分子布朗運動，導致肝纖維化形成與發展的各種病因引起肝細胞損傷、壞死及炎癥反應，繼而合同大量纖維結締組織異常沉積于肝內，這些病理變化引起水分子擴散運動受限，隨肝纖維化進展，限制作用更明顯，這可能是本研究中ADC值及D值隨著肝纖維化進展逐漸減低的原因，且二者在肝纖維化后期甚至是肝硬化時顯著減低[15]。本研究顯示肝纖維化肝臟D*值低于正常肝臟，提示肝纖維化時肝臟微循環灌注減少，CT灌注[13]已證實，肝硬化組的平均門靜脈灌注較對照組降低，本研究得出D*值在正常肝臟和F1期肝纖維化之間及F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統計學意義，f值的作用各文獻報道結果有差異[10-16]，可能與掃描方案未標準化相關，本研究中f值在F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統計學意義，提示血流灌注在肝纖維化早期變化比較顯著，D*和f值可以作為肝纖維化早期診斷和分期的敏感指標，與Zhang等[15]和Sandrasegaran等[16]的結論相同。且本研究中通過ROC曲線分析顯示D*值在F1期及以上、F2期及以上、F3期及以上肝纖維化具有較高的鑒別診斷效能，ADC在F0～F3期和F4期肝纖維化之間具有最高的鑒別診斷效能。

3.2 本研究的局限性

本研究的局限性：(1)本研究以大鼠肝纖維化模型為研究對象，與人類病理變化過程存在差異，研究結果尚不能完全反映人體肝纖維化病理變化特點；(2)IVIM雙指數模型考慮體內的純水分子擴散成分和毛細血管內的偽擴散成分，忽略了體素內其他流動成分對結果的影響；(3)動物實驗樣本量較小，需要進一步擴大樣本量證實研究結果的可靠性與可重復性。

綜上，IVIM雙指數模型多參數值可以從水分子擴散和微循環灌注兩方面診斷及評估肝纖維化水平，比DWI單指數模型更真實地表現肝纖維化病理變化特點，D*值、ADC值對肝纖維分期具有應用價值，D*值在鑒別診斷F0～F3期各期之間肝纖維化的效能最高，ADC值鑒別F0～F3期和F4期肝纖維化的效能最高，IVIM雙指數模型多參數值結合DWI單指數模型參數ADC值對肝纖維早、晚期的鑒別診斷和分期更具有價值，但IVIM成像至今沒有一種公認的標準化掃描方案，因此IVIM成像評價肝纖維化程度的價值還有待進一步探索。

利益沖突：無。