紫外吸收波長對人纖維蛋白含量測定的影響

于濤 孫麗麗

摘要：本文探索了高效液相色譜法檢測人纖維蛋白含量的色譜條件，通過對人纖維蛋白溶液紫外光譜的掃描結(jié)果，設定不同波長進行比對，并篩選出適合的波長，為開展進一步分析提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫外光譜;人纖維蛋白含量;測定

中圖分類號： R927 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.14.031

高效液相色譜法和氨基酸分析儀是目前蛋白質(zhì)分析方法中最有效的手段，高效液相色譜法分析原理主要是利用蛋白質(zhì)的氨基與標識化試劑作柱前或柱后衍生，再進行測定。目前，用于反相高效液相色譜檢測氨基酸的柱前衍生試劑近10種，以柱前衍生高效液相色譜法測定纖維蛋白原中的精氨酸也有報道，但其衍生化試劑盒費用高，且需配置熒光檢測器。本實驗參照 《中國藥典》二部（2005版）中高效液相色譜法，采用2，4-二硝基氟苯為柱前衍生劑，以紫外吸收檢測器檢測不同波長的吸收效果，選出最佳的吸收波長。

1 材料與方法

1.1 樣品準備

人纖維蛋白原為BIOSHARP公司產(chǎn)品，規(guī)格：100mg/支，Exp：2017/03。

1.2 主要試劑及儀器

磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，乙腈（色譜純），凝膠色譜柱Shodex KW-802.5，島津紫外檢測器，普析TU-1901型紫外分光光度計。

1.3 流動相及樣品溶液的制備

流動相采用乙腈-磷酸鹽緩沖溶液，稱取磷酸二氫鈉9.5g，磷酸氫二鈉1.25g，置于500mL容量瓶中，超純水溶解并定容，另取500mL乙腈與其混合，用0.45μm有機膜過濾。

1.4 樣品處理

精密量取樣品溶液1mL，加入相對應的流動相乙腈-磷酸鹽緩沖液和乙腈-純水溶液99mL，充分混勻，靜止30min，進行蛋白質(zhì)沉淀，離心5min，取上層清液進行測定。

1.5 色譜條件

采用凝膠色譜柱Shodex KW-802.5（5μm，8*300 mm）;流速1mL/min;波長設定為205nm、215nm、230nm、280nm;柱溫40℃;采用島津LC-15C色譜工作站;進樣量20μL。

1.6 實驗方法

分別在不同波長下分析蛋白分子保留時間及色譜峰吸收強度，篩選最適合的實驗條件。

2 實驗結(jié)果

掃描紫外光譜，波長200～350nm，結(jié)果見圖1。

通過掃描紫外光譜可得出蛋白溶液200～230nm內(nèi)有較強吸收強度，在250～300nm有較弱的吸收強度，故設定檢測波長為205nm、215nm、230nm、280nm。

不同吸收波長下檢測結(jié)果（流動相配比為乙腈：磷酸鹽緩沖液=1：1）。

在波長為205nm下進行檢測，結(jié)果見圖2。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強度不高，各氨基酸組分分離度≤0.5，色譜峰存在一定拖尾現(xiàn)象，分離效果不理想。

在波長215nm下進行檢測，結(jié)果見圖3。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強度較好，各氨基酸組分分離度≥1.5，色譜峰對稱性理想，分離效果較為滿意。

在波長230nm下進行檢測，結(jié)果見圖4。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強度降低，各氨基酸組分分離度≤1，色譜峰對稱性不理想，且蛋白組分比例發(fā)生明顯變化，分離效果不滿意，不建議在此波長下分析檢測。

在波長280nm下進行檢測，結(jié)果見圖5。

由色譜圖結(jié)果可得出，色譜峰的吸收強度大幅降低，各氨基酸組分分離度≤0.5，色譜峰對稱性很不理想，且蛋白組分無法分離，此波長不適合進行蛋白質(zhì)的分析檢測。

3 結(jié)論

本實驗建立的色譜方法采用凝膠色譜柱進行分離，通過多次單因素實驗，確定在215nm波長下蛋白分子有最佳吸收強度和分離度，通過對此次實驗方法條件的摸索，得到最適合吸收波長實驗條件，測定結(jié)果穩(wěn)定，有良好的重復性，可直接用于人纖維蛋白含量測定，用于進一步實驗研究。

參考文獻

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作者簡介：于濤，碩士，中級講師，研究方向：玉米深加工、儀器分析。