丹參片的超高效液相色譜指紋圖譜

秦學(xué)玲，康紹建，馬娜，蔣新平，楊璐璐

丹參片是以唇形科植物丹參為原料而制成的片劑，具有活血化瘀等功效[1]。丹參片對軍事訓(xùn)練中的急慢性損傷均具有較好的活血化瘀及緩解腫痛的作用。丹參片的主要成分為以丹酚酸B為代表的水溶性成分和以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性成分[2-12]。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-16]，運(yùn)用UPLC法對抽到的全部批次丹參片樣品開展了指紋圖譜的研究，建立了丹參片的UPLC指紋圖譜共有模式，確定了13個峰為共有峰，所有樣品的相似度均在0.90以上；指認(rèn)了其中的11個共有峰。該方法能在30 min內(nèi)檢測丹參片中的多種成分，操作簡便、快速，可為丹參片的整體質(zhì)量控制提供參考。

本研究起止時間為2015年2—12月。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 UPLC儀Agilent Technologies 1290 lnfinity系統(tǒng)，(美國安捷倫公司)；天平：AW220電子天平(日本島津公司)；對照品丹參素鈉(批號201403)、迷迭香酸(批號201203)、丹酚酸B(批號201407)、丹參酮ⅡA(批號201409)、原兒茶醛(批號201307)、丹參酮Ⅰ(批號201209)、隱丹參酮(批號201312)、熊果酸(批號201209) 均購自中國食品藥品檢定研究院；紫草酸(批號27342-47-5)、丹酚酸A對照品(批號98361-23-6)、二氫丹參酮Ⅰ對照品(批號68351-80)均購自西亞公司，標(biāo)示含量均大于99%；乙腈為色譜純，水為高純水(自制)，其它試劑均為分析純；丹參片為從 8個生產(chǎn)廠家抽取的74批次樣品。

1.2 色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，以0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～10 min,4%B→18%B;10～15 min,18%B→33%B;15～19 min,33%B→49%B;19～37 min,49%B→79%B);柱溫19 ℃,樣品管理器溫度3.5 ℃;流速為0.25 mL/min;以丹酚酸B為參照峰，檢測波長280 nm。

1.3 對照品溶液的制備 取丹參素鈉；二氫丹參酮；隱丹參酮；丹參酮Ⅰ；丹參酮ⅡA；熊果酸；原兒茶醛；迷迭香酸；紫草酸；丹酚酸B；丹酚酸A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.713 2、0.075 03、0.160 2、0.090 4、0.180 3、0.300 2、0.083 7、0.399 1、0.330 3、0.499 5、0.413 2 mg/mL的對照品溶液，即得。

1.4 供試品溶液的制備 取供試品適量，除去包衣，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入75%甲醇適量，超聲處理25 min(功率：300 W；頻率：50 kHz)，放冷用75%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 陰性樣品溶液的制備 取由寧夏啟元國藥有限公司提供的陰性樣品，照“1.4”項下的方法制備，即得。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 精密度試驗 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備丹參片樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，參照“1.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，以5號峰(丹酚酸B)為參照峰，計算13個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，13個色譜峰的相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于1.0%。說明該儀器具有較好的的精密度。

1.6.2 重復(fù)性試驗 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備6份丹參片樣品溶液，參照“1.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示指紋圖譜相似度的值均在0.98以上,13個色譜峰相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于1.0%。說明所建立的方法具有較好的重復(fù)性。

1.6.3 穩(wěn)定性試驗 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備丹參片樣品溶液，參照“1.2”項下色譜條件分別于0、3、6、9、14、22 h內(nèi)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示指紋圖譜相似度值為1,13個色譜峰相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于1.0%。說明，丹參片樣品溶液在室溫放置22 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

1.7 指紋圖譜的建立

1.7.1 共有峰的歸屬 取批號為141211的丹參片參照“1.4”項下方法制備丹參片樣品溶液，取“1.3”項下制備對照品溶液；參照“1.2”項下色譜條件進(jìn)行測定。指認(rèn)了11個主要色譜峰，從左到右依次為：丹參素鈉(1號峰)、原兒茶醛(2號峰)、迷迭香酸(3號峰)、紫草酸(4號峰)、丹酚酸B(5號峰)、丹酚酸A(6號峰)、二氫丹參酮Ⅰ(8號峰)、丹參酮Ⅰ(9號峰)、隱丹參酮(10號峰)、熊果酸(11號峰)、丹參酮ⅡA(13號峰)。

1.7.2 指紋圖譜共有模式的建立及數(shù)據(jù)處理 對所抽到的8個生產(chǎn)廠家74批次丹參片樣品進(jìn)行測定，生成丹參片的指紋圖譜共有模式，詳見圖1～9。并對74批丹參片樣品UPLC指紋圖譜進(jìn)行了分析，以丹酚酸B為參照峰S，確定了13個峰為共有峰,計算其相似度，詳見表1,2。

2 結(jié)果

(1)通過對不同企業(yè)指紋圖譜的建立與分析可知(詳見圖2和表1)，供試品色譜圖的相似度均在0.9以上。其中E企業(yè)樣品相似度最好(相似度：0.998)，說明其產(chǎn)品質(zhì)量控制較好，而C企業(yè)樣品相似度相對較差(相似度：0.901)，說明其產(chǎn)品質(zhì)量控制相對較差。

(2)通過對同一企業(yè)不同批次間指紋圖譜的建立與分析可知(見圖3～9和表2)，供試品色譜圖的相似度均在0.900以上，均符合規(guī)定，合格率為100%。其中E企業(yè)各批次間的樣品相似度最好，其相似度范圍為0.998～1.000，說明其整個過程中批次間產(chǎn)品質(zhì)量控制較好，而C企業(yè)各批次間的樣品相似度相對較差，其相似度范圍為0.910～1.000，說明其整個過程中批次間產(chǎn)品質(zhì)量控制較差，這與前期調(diào)研和提取工藝的研究結(jié)果基本一致。

(3)本研究建立的方法能在30 min內(nèi)檢測丹參片中的多種成分，操作簡便、快速，具有較好的專屬性和穩(wěn)定性，可為丹參片的整體質(zhì)量控制提供參考。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-16]，最后確定供試品溶液制備方法為：取供試品適量，除去包衣，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入75%甲醇適量，超聲處理25 min(功率：300 W；頻率：50 kHz)，放冷，用75%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.2 μm微孔濾膜濾過，即得。

圖1 丹參片UPLC圖譜(共有模式)：A為混合對照品，B為丹參片樣品，C為陰性樣品

圖2 8個不同生產(chǎn)企業(yè)丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖3 企業(yè)A丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖4 企業(yè)B丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖5 企業(yè)C丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖6 企業(yè)D丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖7 企業(yè)E丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖8 企業(yè)F不同批次間丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

圖9 企業(yè)G丹參片樣品的UPLC指紋圖譜

企業(yè)名稱相似度數(shù)據(jù)文件對照圖譜.Scp1.000A企業(yè)-280.cdf0.915B企業(yè)-280.cdf0.980C企業(yè)-280.cdf0.901D企業(yè) -280.cdf0.911E企業(yè) -280.cdf0.998F企業(yè) -280.cdf0.923G企業(yè) -280.cdf0.916H企業(yè) -280.cdf0.991

表2 各企業(yè)不同批次間丹參片指紋圖譜相似度范圍分析結(jié)果

注：限度規(guī)定相似度不得低于0.850

3.2 色譜條件的選擇 本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-16]，最后確定色譜條件為：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，以0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～10 min,4%B→18%B;10～15 min,18%B→33%B;15～19 min,33%B→49%B;19～37 min,49%B→79%B);柱溫19 ℃,樣品管理器溫度3.5 ℃;流速為0.25 mL/min;以丹酚酸B為參照峰，檢測波長280 nm。

3.3 參照峰的選擇 酚酸性成分是丹參片中一類主要活性成分，其中丹酚酸B為丹參片中酚酸性成分的代表，其在丹參片中的含量最高，并且是2015版中國藥典規(guī)定的含量測定項目，因此我們選擇丹酚酸B作為參照峰。

3.4 不足 因H企業(yè)只抽到1批次樣品，所以未作批次間指紋圖譜的研究。