新疆南疆某牛場牛副結核流行病學調查研究

穆拉提·阿不都米吉提 石長青 吳建勇 朱廣藝 王廷龍 胡建軍*

（1塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300）（2新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆烏魯木齊830000）

副結核病（Paratuberculosis）是由禽分枝桿菌副結核亞種（Mycobactrium avium subsp.paratuberculosis，MAP）引起的一種慢性傳染病。犢牛感染后通常會有2～5年的亞臨床感染期，期間動物機體日漸消瘦，體重下降、營養不良，發生低蛋白血癥，導致感染牛跛行、乳房炎、消化道和呼吸道疾病發病率高出1～5倍［1,2]。感染牛作為傳染源，間歇性向外通過糞便排菌，增加其他牛暴露風險。因此定期檢測、早期發現牛副結核對規模化牛場的防控、凈化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品的處理

1.1.1 血樣的采集與處理

以“95%的置信區間，50%最大預計流行率”為原則的抽樣策略，采集新疆南疆某牛場2年齡以上泌乳牛血清樣品80份，-20℃保存用于副結核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測。

1.1.2 糞樣的采集與處理

根據牛副結核血清抗體ELISA檢測結果，采集陽性牛直腸糞便樣品，放置-20℃保存用于副結核分枝桿菌的病原學檢測。

1.2 主要試劑

副結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒（Mycobacterium paratuberculosis Antibody Test Kit），購 自 愛 德 士（IDEXX）北京元亨生物科技有限公司（貨號：P07130-10，批號：8070）。抗酸染色染料由塔里木畜牧科技重點實驗室所提供。副結核分枝桿菌（ATCCBAA-968）的陽性質粒由新疆畜牧科學院獸醫研究所提供。DNA凝膠回收試劑盒、QIAamp?DNA Stool Mini Kit、2×Taq PCR MasterMix、D2000 Marker均購于天根生化科技（北京）有限公司。擴增所用副結核分枝桿菌IS900引物序列鑒定引物序列參考Moss等［3]。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 副結核分枝桿菌IS900分子鑒定引物序列

亞型擴增所用副結核分枝桿菌DMC529、DMC531、DMC533引物序列其參考Collins等［4]。

表2 副結核分枝桿菌DMC亞型分子鑒定引物序列

1.3 儀器

多功能全波長96孔酶標儀（Synergy H1/美國BioTek公司）。PCR儀（TC-5000，英國TECHNE公司），小型高速冷凍離心機（Centrifuge 5415R，Eppendorf公司），電泳儀（Thermal cycler Block，Thermo Fisher公司），凝集成像儀（Gel DocTM XR+，Bio-RAD公司）。

1.4 副結核分支桿菌參考菌株序列

本研究中涉及的細菌參考株序列均下載于NCBI中GenBank，見表3。

表3 參考菌株

續上表

1.5 方法

1.5.1 牛副結核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測

按照副結核分枝桿菌抗體ELISA檢測試劑盒（愛德士北京元亨生物科技有限公司）操作說明書，對采集的80份奶牛血清樣品進行檢測。

1.5.2 抗酸性染色

稱取副結核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測陽性牛直腸糞便樣品200 g，加入0.5%NaOH溶液，在55℃條件下水浴30 min。四層紗布過濾，除去雜物，取濾液加入2 ml離心管，12 000 rpm/min速度離心5min。棄去上清，富集沉淀物，取少量沉淀物在玻片中心5 mm×2.5 mm范圍內進行涂片，用萋-尼抗酸染色法進行染色鏡檢。

1.5.3 PCR鑒定

按照QIAamp?DNA Stool Mini Kit說明書，取富集沉淀物進行DNA的提取。IS900基因PCR擴增程序：95℃ 預變性5 min；95℃ 變性40 s、58℃ 退火40 s、72℃延伸70 s，30個循環；72℃延伸10 min；亞型分型PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀中觀察目的片段。擴增產物經膠回收，測序，分析。

2 結果

2.1 牛副結核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測結果

80份血清樣品經牛副結核血清抗體ELISA檢測，其中4份為陽性樣品，陽性率為5.0%（95%置信區間CI，1.38%～12.31%）。根據試驗結果，采集副結核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測陽性牛直腸糞便樣品，分別標記8T、8U、8V、8W，如1.1.2所述處理。

2.2 抗酸染色結果

已采集的副結核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測陽性牛直腸糞便樣品，經抗酸性染色鏡檢，可見背景及其它細胞為藍色，有呈紅色的短桿狀菌體。見圖1。

圖1 糞便樣品抗酸染色 10×100

2.3 IS900基因PCR鑒定結果

提取經檢測為副結核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測陽性牛，8T、8U、8V、8W糞便樣品DNA，用副結核分枝桿菌IS900分子鑒定引物作PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得長度約400 bp的預期擴增片段，見圖2。

圖2 副結核分枝桿菌IS900基因PCR鑒定

2.4 DMC基因PCR擴增結果

采用副結核分枝桿菌亞型分型鑒定引物DMC529、DMC531、DMC533，對8T、8U、8V、8W 樣品作PCR擴增、產物經1%瓊脂凝膠電泳，獲得長度約310 bp大小的擴增片段，見圖3。

圖3 副結核分枝桿菌DMC基因PCR鑒定

2.5 IS900與DMC基因核苷酸同源性比較及系統進化樹構建

8T、8U、8V、8W 樣品經測序，其序列相似性為100%。因此，本文只用8T樣品IS900基因序列（8TMAP-IS900）與DMC基因序列（Subtype-8T）作BLAST。發現8T-MAP-IS900基因序列與Gen Bank中AF305073.1、CP005928.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1、FJ775181.1、FJ775182.1、JQ837281.1等副結核分支桿菌IS900序列同源性在99%以上；Subtype-8T基因序列與Gen Bank中CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1、CP010114.1、CP021238.1、CP033688.1等副結核分支桿菌DMC序列同源性在96.00%以上，序列基本信息如表3所示。

應用DNAstar，8T-MAP-IS900序列與副結核分枝桿菌IS900參考序列進行核苷酸同源性比較分析（見表4）。結果顯示，8T-MAP-IS900與JQ837281.1兩者同源性為100%，與FJ775181.1、FJ775182.1序列比對，同源性分別為99.5%，99.2%，與其他序列同源性均為99.7%。

表4 8T-MAP-IS900與副結核分枝桿菌參考菌株IS900序列同源性比較

根據副結核分枝桿菌IS900基因核苷酸序列同源性比較分析，構建系統進化樹，如圖4所示。8TMAP-IS900與JQ837281.1、AF305073.1、CP005928.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1在遺傳進化上具有高度親緣性。

應用DNAstar，Subype-8T序列與副結核分枝桿菌DMC參考序列進行核苷酸同源性比較分析（見表5）。 結 果 顯 示 ，Subtype-8T 與 CP010114.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等序列同源性均為99.4%。

圖4 副結核分枝桿菌IS900基因系統進化樹

表5 Subtype-8T與副結核分枝桿菌參考菌株DMC序列同源性比較

根據Subtype-8T副結核分枝桿菌DMC基因核苷酸序列同源性比較分析，構建系統進化樹，如圖5所 示 。 Subtype-8T 與 CP010114.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等序列在遺傳進化上具有高度親緣性。

圖5 副結核分枝桿菌DMC基因系統進化樹

3 討論

根據我國近年報道，從2012年至今已有3個直轄市，5個自治區，10個省份已報道檢出牛副結核病，其中包括山東（29.34%）［5]、內蒙古（14.1%）［6]、安徽（8.0%）［7]、河南（5.63%）［8]、寧夏（4.29%）［9]等地區。孫雨等對2014-2015年對來自新疆的部分牛血清樣品進行了血清學流行病學調查，發現陽性率為2.2%［10]，本試驗以預計流行率的抽樣策略，共檢測80份2年齡以上泌乳牛血清樣品，檢出4份陽性血清，該場牛副結核陽性率為5.0%，與孫雨等報道相比高出近兩倍。牛副結核亞臨床期長，不易引起獸醫與飼養人員的注意和關注，該病是長期營養消耗的慢性傳染病，亞臨床期具有不定期排菌、不易表現臨床癥狀等特點，凈化較困難，在市場上目前針對該病尚無特效藥或有效疫苗，因此感染將會對奶牛場帶來嚴重的經濟損失。

應用分子生物學技術于副結核分枝桿菌，可快速獲得準確的診斷或鑒定結果，由于副結核分枝桿菌存在遺傳異質性，根據培養特性和致病力分為Ⅰ（羊）型，Ⅱ（牛）型及Ⅲ（生物中間）型。本試驗測序獲得的8T-MAP-IS900序列與Subtype-8T序列基因比對結果，與 CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等參考菌株的IS900序列同源性均為99.7%、DMC序列同源性為99.4%，從而確定該場存在Ⅱ型副結核分枝桿菌的感染。

吳建勇［11]在2016年報道新疆一些牛場地區存在Ⅱ（牛）型副結核分枝桿菌，2018年高建鵬［12]等所報道新疆北疆某規模化牛場也存在Ⅱ（牛）型副結核分枝桿菌。Ⅱ（牛）型副結核分枝桿不僅感染牛也存在馬鹿感染的情況，王娜等報道，新疆地區馬鹿也有Ⅱ型副結核分枝桿菌感染的情況［13]。本試驗通過血清學檢測，細菌學萋-尼氏抗酸染色鏡檢，PCR擴增IS900基因及亞型基因鑒定并分析，證實在新疆南疆地區某牛場中存在Ⅱ（牛）型副結核分枝桿菌感染。根據本試驗通過對新疆南疆某牛場牛副結核流行病學調查結果，目前新疆地區牛副結核存在感染的情況，為防止進一步感染傳播，應盡早引起關注。

牛副結核主要通過誤食帶菌污染糞便及飼草料而傳播，隔離是控制該病的有效措施之一。根據Malinee等［14]報道，嚴格進行每年血清學檢測與隔離，減少犢牛與陽性群的接觸，可有效防制該病。ELISA檢測技術具有高效、快速、經濟的特點，敏感性、特異性高的優點，能快速篩查牛群中是否存在牛副結核感染，但在檢測過程中需要特別注意的是2年齡前的育成牛或者處于早期感染的牛易出現假陰性結果，因此，在檢測時要特別注意奶牛年齡的選擇以及檢測試劑盒的敏感性、特異性。

通過本試驗對牛副結核病的病原鑒定及基因分型分析，為新疆南疆地區牛場牛副結核的病原學研究、流行病學調查提供了重要的參考數據，為開展牛副結核病防控、凈化提供了理論依據。