米炒靈芝的炮制工藝研究

陳欣茵 馮楚茵 林潔微 李漢輝 宋薇薇 夏 荃*

（1 廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2 珠海李氏百草飲片有限公司，廣東 珠海 519000）

靈芝 ［Ganoderma lucidum（Curtis：F）rKarst］.，是一常用中藥，有保肝、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、調節免疫力等功效［1］。作為藥食兼用菌，靈芝質地堅硬，煎煮過程中其有效成分不易煎出［2-4］。故通過適當的炮制方法如炒法等，使靈芝的有效成分更多地溶出，對于提高靈芝的功效有重要意義。當代經大量藥理研究表明，靈芝中的兩大活性成分——靈芝多糖、靈芝三萜的含量與靈芝功效密切相關，二者是靈芝治療多種疾病的物質基礎［5-8］。本實驗以靈芝多糖、靈芝三萜的含量變化為主要評價指標，優化靈芝的米炒法炮制工藝，為以后靈芝的日常使用，大規模制劑等提供數據支持，也為靈芝的進一步研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 UV-5500PC紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；AUY220電子天平（日本島津公司）；DHS20-1多功能紅外水份儀（上海精密科學儀器有限公司）；TN40ALC紅外測溫儀（寶安康電子（北京）有限公司）。

1.2 試劑 葡萄糖（天津市大茂化學試劑廠，批號：20091020）；蒽酮（Aladdin Industrial Corporation，批號：1427042）；齊墩果酸（中國食品藥品檢定研究所，批號：110709-201607）；其他試劑均為分析純。

1.3 藥材 靈芝（珠海李氏百草飲片有限公司提供，批號：20160401，經廣州中醫藥大學中藥學院中藥鑒定學教研室黃海波副教授鑒定為多孔菌科真菌紫芝Ganoderma sinense的干燥子實體）。

2 方法與結果

2.1 生靈芝 取原藥材，去凈雜質，切片。

2.2 米炒靈芝 先將炒制容器加熱，加入一定量的米，用中火炒至冒煙時，投入凈靈芝片，拌炒至所需程度，取出，篩去米，放涼。

2.3 水分測定 取樣品粉末（過二號篩）約2 g，精密稱定，置多功能紅外水份儀中，于105℃下加熱30 min，記錄樣品粉末的含水百分比，見表3。

2.4 浸出物測定 取各樣品粉末各約2 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加水50 mL，依2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2201項下的熱浸法，以干燥品計算樣品中水溶性浸出物的含量（%），見表3。

2.5 靈芝多糖含量測定

2.5.1 樣品溶液制備 取樣品粉末約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水60 mL，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用水5 mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 mL，搖勻，在4℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5.2 對照品溶液制備 取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。

2.5.3 標準曲線制備 精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻）6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以水為空白，照紫外-可見分光光度法，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得直線方程y=51.59x+0.037 8，相關系數r=0.9997，無水葡萄糖在3.0~18.0 μg/mL范圍內，濃度與吸光度呈良好的線性關系，見圖1。

圖1 無水葡萄糖標準曲線

2.5.4 精密度試驗 精密量取對照品溶液，置10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，連續測定5次，無水葡萄糖的平均吸光度為0.806，RSD=0.1%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩定性考察 精密量取樣品溶液2 mL置10 mL具塞試管中，分別于 0，10，20，30，40，50，60，90，120，150，180，210 min照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，靈芝多糖的平均吸光度為0.357，RSD=1.4%（n=12），表明樣品溶液在3.5 h內穩定性良好。

2.5.6 重現性試驗 取同一樣品粉末5份，按樣品溶液制備項下的方法制備樣品溶液，精密量取樣品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出樣品溶液中無水葡萄糖含量，以藥材干燥品計算樣品中靈芝多糖平均含量為0.624%，RSD=1.2%（n=5），表明本方法重現性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的樣品粉末（過二號篩）6份各約1 g，按樣品溶液制備項下的方法制備樣品溶液，并于“沉淀物用熱水溶解并轉移至50 mL量瓶中”此步中精密加入相當于樣品中無水葡萄糖含量的無水葡萄糖對照品；精密量取樣品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，計算靈芝多糖的含量和回收率，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 （n=6）

2.5.8 樣品含量測定 精密量取1.2.5的樣品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出樣品溶液中無水葡萄糖的含量，以藥材干燥品計算樣品中靈芝多糖的平均含量，見表3。

2.6 靈芝三萜含量測定

2.6.1 樣品溶液制備 取樣品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）45 min，濾過，濾液置100 mL量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.6.2 對照品溶液制備 取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.6.3 標準曲線制備 精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得） 0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在546 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、含量為橫坐標，繪制標準曲線，得直線方程y=10.437x-0.0575，相關系數r=0.9998，齊墩果酸在0.02~0.08 mg范圍內，含量與吸光度呈良好線性關系，見圖2。

圖2 齊墩果酸標準曲線

2.6.4精密度試驗 精密吸取樣品溶液0.4 mL，按照標準曲線的制備項下的方法顯色后，連續測定6次吸光度值，樣品溶液的平均吸光度為0.288，RSD=0.2%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.6.5 穩定性考察 精密吸取同一樣品溶液0.4 mL，按照標準曲線的制備項下的方法顯色后，分別于0，15，30，45，60，90，120，150，180，210 min 時測定吸光度，樣品溶液的平均吸光度為0.279，RSD=1.9%（n=10），表明樣品溶液顯色后在3.5 h內穩定性良好。

2.6.6 重現性試驗 準確稱取同一樣品粉末5份，按照樣品溶液制備項下的方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液0.4 mL，按照標準曲線的制備項下的方法顯色，測定吸光度，從標準曲線上讀出樣品溶液中靈芝三萜類化合物含量，以藥材干燥品計算樣品中靈芝三萜類化合物平均含量為0.473%，RSD=1.9%（n=5），表明本實驗方法重現性良好。

2.6.7 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的樣品6份各約1.0 g，加入一定量的齊墩果酸對照品，同法制得樣品液，靈芝三萜的含量測定同“標準曲線制備”項下進行，測定吸光度，計算靈芝三萜及甾醇含量和回收率，見表2。

表2 加樣回收率實驗結果 （n=6）

2.6.8 樣品含量測定 精密吸取1.2.6的樣品溶液0.4 mL，按照標準曲線的制備項下的方法，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出樣品溶液中靈芝三萜的含量，以藥材干燥品計算樣品中三萜類成分的含量，見表3。

2.7 實驗結果 米炒靈芝的靈芝水分、水溶性浸出物、三萜類化合物含量測定，見表3。

表3 米炒至不同程度的成分含量測定結果

3 討論

靈芝以生用為多，在實際應用中往往存在煎煮時間長，溶出率低等情況。筆者認為，通過適當的炮制方法，如炒法等，可以使其結構更疏松，或質地酥脆，從而增加其化學成分的溶出，進而增強藥物療效，但目前相關的研究較少。前期研究中，曾選用清炒、砂炒、米炒等3種炮制方法對靈芝進行炮制。實驗過程中發現，靈芝片質地輕松，纖維結構多，清炒由于直接接觸鍋底，容易產生火星，導致藥物焦化；而砂炒法鍋溫更高，藥材在炒制過程中就更容易焦化，這2種炮制方法因實際操作難度大，故不予采用。選用米作固體輔料拌炒靈芝，一方面米作為傳熱的介質可使靈芝受熱均勻，另一方面米在炒制過程中或可通過改變靈芝的質地性狀增加靈芝多糖、靈芝三萜和浸出物的含量，同時米還可以作為判斷指征，以其色澤變化觀察火候。具有一定的優越性。

本實驗采用米炒法對靈芝進行炮制，炮制前生靈芝的靈芝多糖和靈芝三萜只有0.627%和0.470%，炮制后，據實驗數據顯示，除了深黃組的水溶性浸出物含量略微下降外，不論將靈芝炒至何種程度，米炒炮制過的靈芝，其浸出物、多糖和三萜類成分含量均比生品高。結合三者在炮制前后的含量變化，其最佳炮制工藝為將米炒至焦黃色，米用量為20%。這可能是炒制后的靈芝質地酥脆，組織疏松，易于粉碎，而這一質地形狀的改變使得靈芝子實體的致密結構被破壞，維持力減弱，使得在細胞壁內的靈芝多糖和三萜類成分較易溶出所致。將米炒至焦黃色時靈芝的多糖含量急速增加，含量最高，且比用其他米炒制的靈芝多糖含量高出接近1倍；但是炒制程度太過，可能會使部分靈芝三萜類化合物降解，因此，將米炒至焦黃色時靈芝的三萜類成分比深黃組的略有下降，這其中的反應機制還待進一步探討。