補(bǔ)腎填精法對(duì)化療源性卵巢早衰大鼠生育力保存的影響

郭淑敏， 彭慧娟， 周秀麗， 朱玲

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 510405）

腫瘤及自身免疫性疾病發(fā)病率正逐年上升，化療藥是治療此類疾病的重要藥物。部分化療藥物的性腺毒性已經(jīng)得到臨床及實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其中卵巢毒性風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)最高的是烷化劑，以環(huán)磷酰胺（CTX）為代表性藥物。化療藥物治療原發(fā)病的同時(shí)導(dǎo)致年輕女性患者卵巢功能損傷甚至出現(xiàn)卵巢早衰[1]（premature ovarian failure，POF）的副作用日漸凸顯，增加了不孕不育的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響女性患者的生育健康。化療源性POF的發(fā)病機(jī)理及治療藥物的臨床療效評(píng)價(jià)已成為研究熱點(diǎn)。POF西醫(yī)治療方法包括雌孕激素替代治療、促排卵、贈(zèng)卵、卵巢冷凍移植等，手段局限，歷時(shí)長(zhǎng)，效果不甚理想。而中醫(yī)藥因治療POF方法簡(jiǎn)便、療效可靠而被廣泛運(yùn)用于臨床，值得深入研究。明代張景岳創(chuàng)立的補(bǔ)腎填精法代表方左歸丸體現(xiàn)了“陽(yáng)中求陰”的制方特點(diǎn)，有滋腎陰，養(yǎng)精血，兼具活血之功，臨床用于治療POF取得一定的療效[2]。本研究通過(guò)腹腔注射CTX建立化療源性POF大鼠模型，觀察左歸丸干預(yù)后對(duì)化療源性POF大鼠受孕能力的影響，以期為臨床保存化療源性POF患者生育力治療提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇9周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠121只，雄性SD大鼠20只，平均體質(zhì)量180～220 g。由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：44007200026331。實(shí)驗(yàn)前行陰道涂片，有正常動(dòng)情周期的雌鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器 左歸丸，每瓶45 g，河南宛西制藥，生產(chǎn)批號(hào)：150211，國(guó)藥準(zhǔn)字Z41020696）；注射用醋酸曲普瑞林[gonadotropinreleasing hormone（GnRH），商品名：達(dá)菲林]，每瓶3.75 mg，法國(guó)益普生生物制藥公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：H16290，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20140298。CTX，每片0.2 g，由山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：04150403，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023686；（9.0 g/L）氯化鈉注射液（生理鹽水），每瓶100 mL規(guī)格，四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：C17093103-2，國(guó)藥準(zhǔn)字H51021156。IX71倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 左歸丸劑量 按大鼠與人用藥劑量換算公式[3]，已知A組成人每60 kg體質(zhì)量用藥量，欲估算B種動(dòng)物每kg體質(zhì)量用藥劑量，B鼠（g·kg-1）=6.25 ×A人（g·kg-1）≈ 1.875 g·kg-1，人劑量為18 g/60 kg，大鼠平均體質(zhì)量為250 g。計(jì)算所得大鼠左歸丸給藥劑量為1.6 g·kg-1·d-1（設(shè)為中劑量），以此設(shè)定低劑量為0.8 g·kg-1·d-1、高劑量為3.2 g·kg-1·d-1。制粉劑后，分別以過(guò)濾水配制灌胃質(zhì)量濃度：低劑量為0.1 g/mL、中劑量為0.2 g/mL、高劑量為0.4 g/mL。

1.4 分組 將實(shí)驗(yàn)入組動(dòng)物（121只）按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組，模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達(dá)菲林組，非POF左歸丸組，非POF達(dá)菲林組等8組。

1.5 造模與給藥

1.5.1 造模前給藥 POF達(dá)菲林組、非POF達(dá)菲林組需造模前給藥。達(dá)菲林配制濃度為0.75 g/L。從造模前第10天當(dāng)天，POF達(dá)菲林組、非POF達(dá)菲林組每只大鼠給予肌肉注射0.5 mL達(dá)菲林藥液（釋放量為12.5 μg/d），僅1次（10 d后卵巢功能受抑制，處于動(dòng)情間期）。其他各組同時(shí)給予肌肉注射0.5 mL 9.0 g/L生理鹽水，僅1次。

1.5.2 造模 模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達(dá)菲林組，參考文獻(xiàn)[4，5]建立化療源性POF大鼠模型。經(jīng)反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，擬定既導(dǎo)致POF而動(dòng)物死亡率又最低的最小化療劑量：第1天給予腹腔注射CTX負(fù)荷劑量50.0 mg/kg，后以5.0 mg/kg的維持劑量連續(xù)注射14 d，每日1次。而空白組、非POF左歸丸組及非POF達(dá)菲林組大鼠在造模期間僅以9.0 g/L生理鹽水2 mL連續(xù)腹腔注射15 d，每日1次。

1.5.3 造模后給藥 造模結(jié)束后，空白組、模型組給予過(guò)濾水灌胃，POF左歸丸低、中、高劑量組給予左歸丸藥液灌胃，POF達(dá)菲林組給予過(guò)濾水灌胃，非POF左歸丸組給予左歸丸藥液灌胃，非POF達(dá)菲林組給予過(guò)濾水灌胃，每次2 mL，連續(xù)灌胃60 d，每日1次。

1.6 觀察指標(biāo)與方法 分別于灌胃30、60 d后，每組取半數(shù)雌鼠以雌∶雄=2∶1比例合籠交配，次日早晨肉眼觀察雌鼠陰道，取陰道涂片進(jìn)行檢測(cè)。以肉眼發(fā)現(xiàn)陰栓，陰道涂片顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子為受孕標(biāo)志，當(dāng)日作為“受孕日”。持續(xù)合籠15 d，如檢測(cè)到陰栓及精子則停止試孕，單獨(dú)放置。合籠15 d結(jié)束后，解剖大鼠，裸眼觀察子宮情況，統(tǒng)計(jì)胚胎著床情況，計(jì)算受孕率。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用STATA.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。當(dāng)n≥40且所有T≥5時(shí)，用卡方檢驗(yàn)基本公式或者四格表資料的卡方檢驗(yàn)專用公式；當(dāng)n≥40但1≤T＜5時(shí)，用卡方檢驗(yàn)的連續(xù)校正或者Fisher確切概率法；當(dāng)n＜40或者T＜1時(shí)，用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左歸丸干預(yù)化療源性POF大鼠受孕結(jié)果 見表1。

2.1.1 灌胃30、60 d后POF大鼠受孕率比較 化療結(jié)束30 d，與空白組比較，模型組受孕率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，P＜0.05）；POF左歸丸低、中、高劑量組及POF達(dá)菲林組受孕率與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.105、0.228、0.228、0.061，P＞0.05）。非POF達(dá)菲林組及非POF左歸丸組受孕率為100%，與空白組一致。與模型組比較，POF左歸丸中、高劑量組，非POF達(dá)菲林組、非POF左歸丸組受孕率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.029、0.029、0.000、0.001，P ＜ 0.05）。POF左歸丸低劑量組及POF達(dá)菲林組受孕率與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.082、0.206，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組受孕率與POF達(dá)菲林組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.62、0.335、0.335，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組灌胃30 d后受孕率組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

灌胃60 d后，與空白組比較，模型組受孕率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021，P＜0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達(dá)菲林組受孕率與空白組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.070、 1.000、 0.105、 0.105， P＞0.05）。 非POF達(dá)菲林組、非POF左歸丸組受孕率均為100%，與空白組一致。與模型組比較，非POF左歸丸組、非POF達(dá)菲林組受孕率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.021、0.002，P＜0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達(dá)菲林組受孕率與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值分別為 1.000、0.057、0.620、0.620，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組受孕率與POF達(dá)菲林組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為1.000、0.335、1.000，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組灌胃60 d后受孕率組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達(dá)菲林組灌胃30 d與60 d后受孕率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其他各組灌胃30、60 d后受孕率均為100%。

2.1.2 各組大鼠累計(jì)受孕率比較 與空白組比較，模型組，POF左歸丸低、高劑量組，POF達(dá)菲林組累計(jì)受孕率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.000、0.007、0.023、0.003，P ＜ 0.05）。POF左歸丸中劑量組累計(jì)受孕率與空白組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.132，P＞0.05），考慮中劑量組療效更佳。非POF達(dá)菲林組、非POF左歸丸組受孕率均為100%，與空白組一致。與模型組比較，POF左歸丸中、高劑量組，非POF達(dá)菲林組，非POF左歸丸組累計(jì)受孕率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.002、0.027、0.000、0.000，P＜0.05）。POF左歸丸低劑量組、POF達(dá)菲林組累計(jì)妊娠率與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.121、0.121，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組累計(jì)受孕率與POF達(dá)菲林組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為1.000、0.094、0.500，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組累計(jì)受孕率組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.286，P＞0.05）。

表1 左歸丸干預(yù)化療源性POF大鼠受孕情況Table 1 The results for Zuogui Pills intervening the pregnancy of chemotherapy-induced POF rats

2.2 裸眼觀察各組大鼠子宮形態(tài) 空白組大鼠子宮宮體紅潤(rùn)，呈串珠狀，胚胎著床處子宮膨大，充血明顯，胚胎著床位點(diǎn)分布相對(duì)均勻，大小相對(duì)一致；模型組大鼠子宮顏色蒼白，宮體細(xì)長(zhǎng)，懷孕大鼠子宮呈不規(guī)則串珠狀，充血較空白組少，胚胎著床位點(diǎn)量少且分布不均勻，大小不等；POF左歸丸各劑量組大鼠子宮宮體紅潤(rùn)，呈串珠狀改變，胚胎著床位點(diǎn)分布較空白組稀疏且不均勻，大小相對(duì)一致；非POF達(dá)菲林組、非POF左歸丸組大鼠子宮宮體紅潤(rùn)，呈串珠狀，充血明顯，胚胎著床位點(diǎn)分布均勻，大小相對(duì)一致；POF達(dá)菲林組大鼠宮體細(xì)長(zhǎng)，顏色較蒼白，胚胎著床位點(diǎn)分布稀疏且不均勻。

3 討論

CTX引起的生殖功能障礙嚴(yán)重影響患者的生育健康和生存質(zhì)量，積極防治化療源性POF、保存女性患者的生育能力的問(wèn)題具有重要的意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎氣充盛、沖任和調(diào)是卵巢功能表現(xiàn)正常的基礎(chǔ)。反之，腎氣虛及沖任失調(diào)則會(huì)導(dǎo)致卵巢功能調(diào)節(jié)異常或卵巢功能衰竭[6]。本課題組朱玲教授[7]認(rèn)為腎精虧虛、天癸匱源、沖任虛憊是POF的病機(jī)基礎(chǔ)，POF的治療當(dāng)以補(bǔ)腎為大法。

月經(jīng)情況、性激素水平、生殖能力都是反映卵巢功能的指征。對(duì)于有生育需求的POF女性患者來(lái)說(shuō)，保存或改善生育力是最終目標(biāo)。

本課題組前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，左歸丸可修復(fù)免疫性POF小鼠卵巢免疫性炎癥損傷，上調(diào)卵泡及卵巢間質(zhì)Bcl-2蛋白及下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，從而抑制卵泡的過(guò)快凋亡。另外，有研究[9]表明，左歸丸能顯著提高CTX化療源性POF大鼠性激素雌二醇（E2）含量，降低促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）含量，從而改善化療所致的卵巢功能損害。陽(yáng)松威等[10]發(fā)現(xiàn)左歸丸可有效增強(qiáng)CTX致POF模型小鼠卵巢組織Cx37 mRNA表達(dá)，上調(diào)Cx37蛋白在卵巢組織中的分布與表達(dá)，改善化療致POF模型小鼠卵巢組織縫隙連接功能，恢復(fù)卵巢功能。劉秀云等[11]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究左歸丸抗CTX毒性，結(jié)果顯示POF左歸丸組FSH較模型組顯著下降。臨床運(yùn)用左歸丸治療POF患者，可使患者FSH水平明顯降低，AMH值明顯升高，有效提高患者卵巢的儲(chǔ)備功能[2]。綜上可見，左歸丸可改善化療源性POF患者的卵巢功能。但最終能否起到保護(hù)患者生育力的作用、保障患者的生殖健康，值得進(jìn)一步研究。本研究以生育力為觀察指標(biāo)，研究左歸丸對(duì)CTX化療源性POF大鼠生育功能的影響。

本研究結(jié)果顯示模型組受孕率明顯低于空白組，表明CTX存在卵巢毒性，可損傷大鼠卵巢功能，降低受孕率；卵巢對(duì)細(xì)胞毒性藥物非常敏感，化療藥物烷化劑CTX可對(duì)卵巢造成不可逆的損害。有研究[12]發(fā)現(xiàn)使用烷化劑患者約40%發(fā)生POF，烷化劑可使年輕女性發(fā)生POF的風(fēng)險(xiǎn)增加9倍。吳倩等[8]研究發(fā)現(xiàn)CTX化療源性POF大鼠卵巢體積明顯縮小，閉鎖卵泡較正常增多，顆粒細(xì)胞層減少且排列紊亂。本研究結(jié)果還顯示，隨著時(shí)間推移，模型組灌胃60 d后受孕率與灌胃30 d后受孕率比較有一定的提高，但仍然低下，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明經(jīng)過(guò)CTX的毒性損傷后不經(jīng)特殊處理，大鼠的卵巢功能雖然有一定的改善，但生育力仍然低下。

本研究結(jié)果顯示，POF左歸丸中、高劑量組灌胃30 d后受孕率及累計(jì)受孕率較模型組明顯上升，表明左歸丸可以提高模型動(dòng)物的受孕率，改善化療源性POF大鼠的生育能力，對(duì)化療藥物CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷具有一定的治療作用。

促性腺激素釋放激素類似劑（GnRHa）達(dá)菲林在臨床應(yīng)用于POF預(yù)防和化療中，對(duì)生育力保護(hù)是否有效仍存在爭(zhēng)議，但使用外源性GnRHa已被證實(shí)可抑制內(nèi)源性促性腺激素FSH至絕經(jīng)前水平，使卵巢卵泡處于靜止?fàn)顟B(tài)，減少化療毒性損傷。有Meta分析[13]顯示，使用GnRHa可以顯著減少年輕惡性腫瘤患者化療后POF的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，POF達(dá)菲林組灌胃30、60 d后受孕率及累計(jì)受孕率與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但受孕率均高于模型組，表明達(dá)菲林在一定程度上能提高CTX化療源性POF大鼠受孕率，改善化療源性卵巢功能損傷。

本研究結(jié)果顯示，POF左歸丸低、中、高3個(gè)劑量組受孕率組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但無(wú)論是灌胃30 d、60 d后受孕率或是累計(jì)受孕率，POF左歸丸中劑量組受孕率均最高，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)POF左歸丸中劑量組大鼠的毛發(fā)、飲食及日常活動(dòng)較POF左歸丸低、高劑量組表現(xiàn)更佳。POF左歸丸中劑量組的灌胃劑量是按照POF左歸丸藥品說(shuō)明書中60 kg成年女性的口服劑量18 g/60 kg換算的，本研究結(jié)果表明左歸丸中劑量治療化療藥物CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷療效最佳。提示臨床常用劑量治療POF患者藥效可能最佳。劑量降低可能導(dǎo)致療效降低。劑量增高，療效未見明顯提升。

本研究裸眼觀察大鼠子宮形態(tài)結(jié)果顯示，CTX的毒性作用可致大鼠子宮蒼白、宮體細(xì)長(zhǎng)，妊娠率下降，胚胎大小及著床位點(diǎn)不均勻。POF左歸丸各劑量組及POF達(dá)菲林組均能改善子宮血供，促進(jìn)胚胎著床，但著床位點(diǎn)與空白組比較相對(duì)分布不均、局部可見宮體顏色較蒼白。

結(jié)合本課題組同期研究成果，認(rèn)為CTX化療會(huì)降低大鼠受孕率，損傷大鼠卵巢功能，而左歸丸可調(diào)節(jié)化療源性POF大鼠內(nèi)分泌水平，促進(jìn)卵泡及黃體生長(zhǎng)，減少卵泡閉鎖，抑制卵泡凋亡（另文發(fā)表），從而修復(fù)卵巢功能，促進(jìn)胚胎著床，提高受孕率，改善生育能力，對(duì)CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷具有一定的治療作用。基于此，本研究下一步將進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制以及胚胎毒性（如活產(chǎn)率、畸胎情況）等問(wèn)題。可見，中醫(yī)藥防治POF是一個(gè)具有發(fā)展前景的研究方向，對(duì)防治化療源性POF、保存年輕女性患者生育力、提高生活質(zhì)量具有重要意義。