補腎填精法對化療源性卵巢早衰大鼠生育力保存的影響

郭淑敏， 彭慧娟， 周秀麗， 朱玲

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州 510120；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦產科，廣東廣州 510405）

腫瘤及自身免疫性疾病發病率正逐年上升，化療藥是治療此類疾病的重要藥物。部分化療藥物的性腺毒性已經得到臨床及實驗證實，其中卵巢毒性風險系數最高的是烷化劑，以環磷酰胺（CTX）為代表性藥物。化療藥物治療原發病的同時導致年輕女性患者卵巢功能損傷甚至出現卵巢早衰[1]（premature ovarian failure，POF）的副作用日漸凸顯，增加了不孕不育的風險，嚴重影響女性患者的生育健康。化療源性POF的發病機理及治療藥物的臨床療效評價已成為研究熱點。POF西醫治療方法包括雌孕激素替代治療、促排卵、贈卵、卵巢冷凍移植等，手段局限，歷時長，效果不甚理想。而中醫藥因治療POF方法簡便、療效可靠而被廣泛運用于臨床，值得深入研究。明代張景岳創立的補腎填精法代表方左歸丸體現了“陽中求陰”的制方特點，有滋腎陰，養精血，兼具活血之功，臨床用于治療POF取得一定的療效[2]。本研究通過腹腔注射CTX建立化療源性POF大鼠模型，觀察左歸丸干預后對化療源性POF大鼠受孕能力的影響，以期為臨床保存化療源性POF患者生育力治療提供參考，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇9周齡SPF級雌性SD大鼠121只，雄性SD大鼠20只，平均體質量180～220 g。由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物許可證號：44007200026331。實驗前行陰道涂片，有正常動情周期的雌鼠納入實驗。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 左歸丸，每瓶45 g，河南宛西制藥，生產批號：150211，國藥準字Z41020696）；注射用醋酸曲普瑞林[gonadotropinreleasing hormone（GnRH），商品名：達菲林]，每瓶3.75 mg，法國益普生生物制藥公司生產，產品批號：H16290，進口藥品注冊證號：H20140298。CTX，每片0.2 g，由山西普德藥業股份有限公司生產，生產批號：04150403，國藥準字H14023686；（9.0 g/L）氯化鈉注射液（生理鹽水），每瓶100 mL規格，四川科倫藥業股份有限公司生產，批號：C17093103-2，國藥準字H51021156。IX71倒置熒光顯微鏡，購自日本Olympus公司。

1.3 左歸丸劑量 按大鼠與人用藥劑量換算公式[3]，已知A組成人每60 kg體質量用藥量，欲估算B種動物每kg體質量用藥劑量，B鼠（g·kg-1）=6.25 ×A人（g·kg-1）≈ 1.875 g·kg-1，人劑量為18 g/60 kg，大鼠平均體質量為250 g。計算所得大鼠左歸丸給藥劑量為1.6 g·kg-1·d-1（設為中劑量），以此設定低劑量為0.8 g·kg-1·d-1、高劑量為3.2 g·kg-1·d-1。制粉劑后，分別以過濾水配制灌胃質量濃度：低劑量為0.1 g/mL、中劑量為0.2 g/mL、高劑量為0.4 g/mL。

1.4 分組 將實驗入組動物（121只）按隨機數字表隨機分為空白組，模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組，非POF左歸丸組，非POF達菲林組等8組。

1.5 造模與給藥

1.5.1 造模前給藥 POF達菲林組、非POF達菲林組需造模前給藥。達菲林配制濃度為0.75 g/L。從造模前第10天當天，POF達菲林組、非POF達菲林組每只大鼠給予肌肉注射0.5 mL達菲林藥液（釋放量為12.5 μg/d），僅1次（10 d后卵巢功能受抑制，處于動情間期）。其他各組同時給予肌肉注射0.5 mL 9.0 g/L生理鹽水，僅1次。

1.5.2 造模 模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組，參考文獻[4，5]建立化療源性POF大鼠模型。經反復預實驗摸索，擬定既導致POF而動物死亡率又最低的最小化療劑量：第1天給予腹腔注射CTX負荷劑量50.0 mg/kg，后以5.0 mg/kg的維持劑量連續注射14 d，每日1次。而空白組、非POF左歸丸組及非POF達菲林組大鼠在造模期間僅以9.0 g/L生理鹽水2 mL連續腹腔注射15 d，每日1次。

1.5.3 造模后給藥 造模結束后，空白組、模型組給予過濾水灌胃，POF左歸丸低、中、高劑量組給予左歸丸藥液灌胃，POF達菲林組給予過濾水灌胃，非POF左歸丸組給予左歸丸藥液灌胃，非POF達菲林組給予過濾水灌胃，每次2 mL，連續灌胃60 d，每日1次。

1.6 觀察指標與方法 分別于灌胃30、60 d后，每組取半數雌鼠以雌∶雄=2∶1比例合籠交配，次日早晨肉眼觀察雌鼠陰道，取陰道涂片進行檢測。以肉眼發現陰栓，陰道涂片顯微鏡下發現精子為受孕標志，當日作為“受孕日”。持續合籠15 d，如檢測到陰栓及精子則停止試孕，單獨放置。合籠15 d結束后，解剖大鼠，裸眼觀察子宮情況，統計胚胎著床情況，計算受孕率。

1.7 統計方法 采用STATA.12統計軟件進行數據分析，計數資料采用卡方檢驗。當n≥40且所有T≥5時，用卡方檢驗基本公式或者四格表資料的卡方檢驗專用公式；當n≥40但1≤T＜5時，用卡方檢驗的連續校正或者Fisher確切概率法；當n＜40或者T＜1時，用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 左歸丸干預化療源性POF大鼠受孕結果 見表1。

2.1.1 灌胃30、60 d后POF大鼠受孕率比較 化療結束30 d，與空白組比較，模型組受孕率降低，差異有統計學意義（P=0.001，P＜0.05）；POF左歸丸低、中、高劑量組及POF達菲林組受孕率與空白組比較，差異無統計學意義（P值分別為0.105、0.228、0.228、0.061，P＞0.05）。非POF達菲林組及非POF左歸丸組受孕率為100%，與空白組一致。與模型組比較，POF左歸丸中、高劑量組，非POF達菲林組、非POF左歸丸組受孕率均升高，差異有統計學意義（P值分別為0.029、0.029、0.000、0.001，P ＜ 0.05）。POF左歸丸低劑量組及POF達菲林組受孕率與模型組比較，差異無統計學意義（P值分別為 0.082、0.206，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組受孕率與POF達菲林組比較，差異均無統計學意義（P值分別為 0.62、0.335、0.335，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組灌胃30 d后受孕率組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

灌胃60 d后，與空白組比較，模型組受孕率降低，差異有統計學意義（P=0.021，P＜0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組受孕率與空白組比較，差異均無統計學意義（P值分別為 0.070、 1.000、 0.105、 0.105， P＞0.05）。 非POF達菲林組、非POF左歸丸組受孕率均為100%，與空白組一致。與模型組比較，非POF左歸丸組、非POF達菲林組受孕率均升高，差異有統計學意義（P值分別為 0.021、0.002，P＜0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組受孕率與模型組比較，差異均無統計學意義（P 值分別為 1.000、0.057、0.620、0.620，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組受孕率與POF達菲林組比較，差異均無統計學意義（P值分別為1.000、0.335、1.000，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組灌胃60 d后受孕率組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組灌胃30 d與60 d后受孕率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），其他各組灌胃30、60 d后受孕率均為100%。

2.1.2 各組大鼠累計受孕率比較 與空白組比較，模型組，POF左歸丸低、高劑量組，POF達菲林組累計受孕率降低，差異均有統計學意義（P值分別為 0.000、0.007、0.023、0.003，P ＜ 0.05）。POF左歸丸中劑量組累計受孕率與空白組比較，差異均無統計學意義（P=0.132，P＞0.05），考慮中劑量組療效更佳。非POF達菲林組、非POF左歸丸組受孕率均為100%，與空白組一致。與模型組比較，POF左歸丸中、高劑量組，非POF達菲林組，非POF左歸丸組累計受孕率均升高，差異有統計學意義（P值分別為 0.002、0.027、0.000、0.000，P＜0.05）。POF左歸丸低劑量組、POF達菲林組累計妊娠率與模型組比較，差異無統計學意義（P值分別為0.121、0.121，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組累計受孕率與POF達菲林組比較，差異均無統計學意義（P值分別為1.000、0.094、0.500，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組累計受孕率組間比較，差異均無統計學意義（P=0.286，P＞0.05）。

表1 左歸丸干預化療源性POF大鼠受孕情況Table 1 The results for Zuogui Pills intervening the pregnancy of chemotherapy-induced POF rats

2.2 裸眼觀察各組大鼠子宮形態 空白組大鼠子宮宮體紅潤，呈串珠狀，胚胎著床處子宮膨大，充血明顯，胚胎著床位點分布相對均勻，大小相對一致；模型組大鼠子宮顏色蒼白，宮體細長，懷孕大鼠子宮呈不規則串珠狀，充血較空白組少，胚胎著床位點量少且分布不均勻，大小不等；POF左歸丸各劑量組大鼠子宮宮體紅潤，呈串珠狀改變，胚胎著床位點分布較空白組稀疏且不均勻，大小相對一致；非POF達菲林組、非POF左歸丸組大鼠子宮宮體紅潤，呈串珠狀，充血明顯，胚胎著床位點分布均勻，大小相對一致；POF達菲林組大鼠宮體細長，顏色較蒼白，胚胎著床位點分布稀疏且不均勻。

3 討論

CTX引起的生殖功能障礙嚴重影響患者的生育健康和生存質量，積極防治化療源性POF、保存女性患者的生育能力的問題具有重要的意義。

中醫學認為腎氣充盛、沖任和調是卵巢功能表現正常的基礎。反之，腎氣虛及沖任失調則會導致卵巢功能調節異常或卵巢功能衰竭[6]。本課題組朱玲教授[7]認為腎精虧虛、天癸匱源、沖任虛憊是POF的病機基礎，POF的治療當以補腎為大法。

月經情況、性激素水平、生殖能力都是反映卵巢功能的指征。對于有生育需求的POF女性患者來說，保存或改善生育力是最終目標。

本課題組前期研究[8]發現，左歸丸可修復免疫性POF小鼠卵巢免疫性炎癥損傷，上調卵泡及卵巢間質Bcl-2蛋白及下調Bax蛋白的表達，從而抑制卵泡的過快凋亡。另外，有研究[9]表明，左歸丸能顯著提高CTX化療源性POF大鼠性激素雌二醇（E2）含量，降低促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）含量，從而改善化療所致的卵巢功能損害。陽松威等[10]發現左歸丸可有效增強CTX致POF模型小鼠卵巢組織Cx37 mRNA表達，上調Cx37蛋白在卵巢組織中的分布與表達，改善化療致POF模型小鼠卵巢組織縫隙連接功能，恢復卵巢功能。劉秀云等[11]通過動物實驗研究左歸丸抗CTX毒性，結果顯示POF左歸丸組FSH較模型組顯著下降。臨床運用左歸丸治療POF患者，可使患者FSH水平明顯降低，AMH值明顯升高，有效提高患者卵巢的儲備功能[2]。綜上可見，左歸丸可改善化療源性POF患者的卵巢功能。但最終能否起到保護患者生育力的作用、保障患者的生殖健康，值得進一步研究。本研究以生育力為觀察指標，研究左歸丸對CTX化療源性POF大鼠生育功能的影響。

本研究結果顯示模型組受孕率明顯低于空白組，表明CTX存在卵巢毒性，可損傷大鼠卵巢功能，降低受孕率；卵巢對細胞毒性藥物非常敏感，化療藥物烷化劑CTX可對卵巢造成不可逆的損害。有研究[12]發現使用烷化劑患者約40%發生POF，烷化劑可使年輕女性發生POF的風險增加9倍。吳倩等[8]研究發現CTX化療源性POF大鼠卵巢體積明顯縮小，閉鎖卵泡較正常增多，顆粒細胞層減少且排列紊亂。本研究結果還顯示，隨著時間推移，模型組灌胃60 d后受孕率與灌胃30 d后受孕率比較有一定的提高，但仍然低下，差異無統計學意義（P＞0.05），表明經過CTX的毒性損傷后不經特殊處理，大鼠的卵巢功能雖然有一定的改善，但生育力仍然低下。

本研究結果顯示，POF左歸丸中、高劑量組灌胃30 d后受孕率及累計受孕率較模型組明顯上升，表明左歸丸可以提高模型動物的受孕率，改善化療源性POF大鼠的生育能力，對化療藥物CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷具有一定的治療作用。

促性腺激素釋放激素類似劑（GnRHa）達菲林在臨床應用于POF預防和化療中，對生育力保護是否有效仍存在爭議，但使用外源性GnRHa已被證實可抑制內源性促性腺激素FSH至絕經前水平，使卵巢卵泡處于靜止狀態，減少化療毒性損傷。有Meta分析[13]顯示，使用GnRHa可以顯著減少年輕惡性腫瘤患者化療后POF的風險。本研究結果顯示，POF達菲林組灌胃30、60 d后受孕率及累計受孕率與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但受孕率均高于模型組，表明達菲林在一定程度上能提高CTX化療源性POF大鼠受孕率，改善化療源性卵巢功能損傷。

本研究結果顯示，POF左歸丸低、中、高3個劑量組受孕率組間比較，差異無統計學意義。但無論是灌胃30 d、60 d后受孕率或是累計受孕率，POF左歸丸中劑量組受孕率均最高，且實驗過程中發現POF左歸丸中劑量組大鼠的毛發、飲食及日常活動較POF左歸丸低、高劑量組表現更佳。POF左歸丸中劑量組的灌胃劑量是按照POF左歸丸藥品說明書中60 kg成年女性的口服劑量18 g/60 kg換算的，本研究結果表明左歸丸中劑量治療化療藥物CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷療效最佳。提示臨床常用劑量治療POF患者藥效可能最佳。劑量降低可能導致療效降低。劑量增高，療效未見明顯提升。

本研究裸眼觀察大鼠子宮形態結果顯示，CTX的毒性作用可致大鼠子宮蒼白、宮體細長，妊娠率下降，胚胎大小及著床位點不均勻。POF左歸丸各劑量組及POF達菲林組均能改善子宮血供，促進胚胎著床，但著床位點與空白組比較相對分布不均、局部可見宮體顏色較蒼白。

結合本課題組同期研究成果，認為CTX化療會降低大鼠受孕率，損傷大鼠卵巢功能，而左歸丸可調節化療源性POF大鼠內分泌水平，促進卵泡及黃體生長，減少卵泡閉鎖，抑制卵泡凋亡（另文發表），從而修復卵巢功能，促進胚胎著床，提高受孕率，改善生育能力，對CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷具有一定的治療作用。基于此，本研究下一步將進一步深入探討其作用機制以及胚胎毒性（如活產率、畸胎情況）等問題。可見，中醫藥防治POF是一個具有發展前景的研究方向，對防治化療源性POF、保存年輕女性患者生育力、提高生活質量具有重要意義。