miR-145-5p靶向抑制RAD18表達調控替莫唑胺對腦膠質瘤細胞凋亡的影響

鄭忠濤 祝葉 李霞

(海口市人民醫院 1神經外科，海南 海口 570208；2全科醫學；3萬寧市人民醫院神經外科)

腦膠質瘤是老年人群較為常見的原發性顱內腫瘤，也是惡性最高、侵襲性最強的人類惡性癌癥之一〔1〕。目前，腦膠質瘤的治療手段包括手術切除，放射治療和化療〔2〕。然而，所有這些治療策略均已被證明無法完全抑制膠質瘤細胞，這也是腦膠質瘤患者復發率極高的重要原因。我國研究顯示，腦膠質瘤患者的1、2、5年生存率分別為66.0%、45.3%及24.5%，中位生存時間僅約20個月〔3〕。目前，化療是腦膠質瘤患者手術后采用的最主要的輔助治療方法〔2〕。據報道，替莫唑胺是一線化療藥物，對抑制腦膠質瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡具有顯著作用〔4〕。雖然替莫唑胺治療已廣泛用于腦膠質瘤患者，但由于腦膠質瘤細胞耐藥性的形成，其治療效率并不是很高〔5〕。然而，固有或獲得性替莫唑胺抗性的機制尚不清楚。因此，探討替莫唑胺治療耐藥所涉及的分子機制將有助于提高替莫唑胺化療在腦膠質瘤中的療效。微小RNA(miR)是指長度約22個核苷酸的短鏈非編碼RNA，可通過靶向靶基因mRNA 3′-非翻譯區來調節癌基因和腫瘤抑制基因的表達〔6〕。近年研究發現，miR-145-5p在惡性腫瘤中發揮腫瘤抑制性miR作用〔7〕。然而，關于miR-145-5p在腦膠質瘤細胞對替莫唑胺化療藥物敏感性的影響尚未見報道。本研究旨在探討miR-145-5p對調節腦膠質瘤細胞中替莫唑胺化學敏感性的影響，并探討miR-145-5p及其靶基因的分子機制，以克服腦膠質瘤細胞化療藥物耐藥性問題。

1 材料與方法

1.1 研究對象納入與標本采集 選取2012年2月至2017年2月在海口市人民醫院接受手術治療的老年腦膠質瘤60例，年齡62～76〔平均(67.65±3.76)〕歲，女26例，男34例。腦膠質瘤確診依據病理切片。術中采集所有患者外周靜脈血5 ml，3 600 r/min離心分離血清。所有患者于術后口服替莫唑胺膠囊(國藥準字H20040637)，江蘇天士力帝益藥業有限公司生產，7粒/瓶(50 mg)，75 mg/(m2·d)，4 w為1個療程，共4個療程。所有患者門診隨訪或電話隨訪18個月，統計患者復發率和生存率。

1.2 細胞培養和轉染 人腦膠質瘤細胞系U87MG購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。細胞在含有10%胎牛血清(美國Invitrogen公司)，100 U/L青霉素和100 mg/100 L鏈霉素的DMEM改良培養基(美國Hyclone公司)中，于37℃和5%CO2條件下培養。miR-145-5p模擬物，miR-145-5p抑制劑和陰性對照由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)進行細胞轉染。

1.3 miR-145-5p對U87MG細胞替莫唑胺化療敏感性的檢測 將U87MG細胞以每孔3 000個細胞接種于96孔板中并培養過夜以形成貼壁附著。次日，用濃度為200 pmol/L的miR-145-5p模擬物和陰性對照轉染細胞。4 h后，分別加入含有不同濃度替莫唑胺的DMEM，濃度范圍為12.5～800.0 μmol/L，通過MTT測定法測定細胞存活率。孵育48 h后，向每個孔中加入20 μl MTT的完全培養基，孵育4 h后用150 μl二甲基亞砜替換培養基并混合10 min，在492 nm下測量吸光度，計算替莫唑胺的半抑制濃度(IC50)值。

1.4 RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 分別使用血清RNA提取試劑盒(武漢生之源生物科技有限公司)與Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取血清和各組細胞總RNA。采用一步法逆轉錄試劑盒(北京寶日醫生物技術有限公司)將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA后qRT-PCR檢測。U6和GAPDH基因分別用作miR-145-5p和RAD18的內參。采用莖環法逆轉錄miR-145-5p。miR-145-5p和U6的逆轉錄引物分別是5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTTTCAGTTGATGCATTC-3′和5′-CTCAACTGTGTTGGAGTCGGCAATTCAGTAA-AATATGGAAC-3′。miR-145-5p qRT-PCR的引物序列為：上游5′-CCAGCTGGGCTCACTGAACAATGA-3′和下游5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′。U6 qRT-PCR的引物序列為：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′和下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。RAD18的引物序列為：上游5′-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3′和下游5′-GGGCAGGCATGTT GACTTCAC-3′，GAPDH的引物序列為：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′和下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。所有引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。每個樣品檢測3次，以2-ΔΔCT法來定量基因表達水平。

1.5 miR-145-5p靶基因預測和雙熒光素酶報告基因測定 通過TargetScan在線預測RAD18的3′-UTR中miR-145-5p的種子序列，RAD18的野生型全長3′-UTR片段通過PCR進行擴增，純化PCR產物并用限制酶消化并插入pGLO載體中以產生pGLO-RAD18-wt。從RAD18的3′-UTR突變預測的種子序列，使用重疊PCR方法以pGLO-RAD18-mut。以每孔4 000個U87MG細胞接種到96孔板中。使用Lipofectamine2000將pGLO-RAD18-wt，pGLO-RAD18-mut和pGLO共轉染到具有miR-145-5p模擬物或陰性對照的細胞中。使用雙熒光素酶測定試劑盒在轉染后24 h進行熒光素酶測定。每組重復測量3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染陰性對照、miR-145-5p模擬物、替莫唑胺(400 μmol/L)和替莫唑胺(400 μmol/L)+miR-145-5p模擬物孵育48 h后，用Annexin V-APC試劑盒進行U87MG細胞凋亡檢測，檢測儀器為美國伯樂公司FACS Calibur型流式細胞儀。應用AnnexinV-FITC和PI染色15 min。以Annexin V-FITC陽性凋亡細胞的數量占細胞總數的百分比計算細胞凋亡率。每組重復測量3次。

1.7 Western印跡檢測 與miR-145-5p模擬物，miR-145-5p抑制劑，陰性對照，替莫唑胺(400 μmol/L)和替莫唑胺(400 μmol/L)+miR-145-5p模擬物孵育48 h后，在RIPA緩沖液中裂解U87MG細胞。將等量的蛋白質進行SDS-PAGE并轉移至PVDF膜，并與RAD18、Bcl-2、Caspase、GAPDH一抗孵育，再與辣根過氧化物酶耦聯的二抗溫育后，通過在美國伯樂ChemiDoc MP凝膠成像儀上使用增強的化學發光底物試劑盒(美國Thermo Scientific公司)顯現陽性條帶。

1.8 裸鼠成瘤實驗 SPF級雌性4～6周齡無胸腺裸鼠(BALB/c，15～20 g)20只，購自武漢大學動物實驗中心〔SCXK (鄂)2016-0016〕，本研究實驗動物福利倫理委員會的批準號：201801006。根據生物安全及生物倫理指導原則，實驗動物飼養和實驗過程中均按實驗動物3R原則給予人道關懷。

將3×106個U87MG細胞懸浮于100 μl磷酸鹽緩沖鹽水中并皮下接種到20只裸鼠腹腔中建立腦膠質瘤異種移植模型。10 d后當腫瘤可見時，將裸鼠隨機分成4組(n=5)，第1組，將陰性對照(2 nmol)注射到裸鼠腹腔中；第2組，將miR-145-5p(2 nmol)注射到裸鼠腹腔中；第3組，將替莫唑胺(25 mg/kg)注射到裸鼠腹腔中；第4組，將miR-145-5p(2 nmol)和替莫唑胺(25 mg/kg)注射到裸鼠腹腔中。于接種U87MG細胞后第28天處死裸鼠并切除腫瘤稱重。

1.9 統計學分析 采用GraphPad Prism7軟件進行F檢驗、t檢驗及χ2檢驗。

2 結 果

2.1 腦膠質瘤患者術后血清miR-145-5p水平與預后相關性 術后腦膠質瘤患者血清miR-145-5p水平為6.12±1.87(-log)，中位數為6.01(-log)，依據miR-145-5p表達水平的中位數分為高表達組(n=30)和低表達組(n=30)，兩組性別、年齡、吸煙、飲酒史等差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。18個月隨訪后，高表達組共6例復發，2例死亡；低表達組共14例復發，9例死亡。低表達組復發率顯著高于高表達組(χ2=4.800，P=0.028)；而高表達組生存時間顯著高于低表達組(χ2=5.572，P=0.017，圖1)。

2.2 miR-145-5p表達與U87MG細胞對替莫唑胺敏感性的關系 用miR-145-5p模擬物和陰性對照轉染U87MG細胞后，經不同濃度替莫唑胺處理48 h。如圖2所示，與陰性對照組相比，隨著替莫唑胺濃度的增加，miR-145-5p模擬物組細胞活性顯著降低，且miR-145-5p模擬物組可將替莫唑胺的IC50從406 μmol/L降至103 μmol/L。

表1 miR-145-5p高表達組和低表達組間基本資料比較〔n(%),n=30〕

圖1 腦膠質瘤術后血清miR-145-5p水平與患者預后分析

圖2 miR-145-5p表達與U87MG細胞對替莫唑胺敏感性的關系

2.3 miR-145-5p靶基因選擇與驗證 應用TargetScan在線預測(圖3)和雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，pGLO-RAD18-wt組中，miR-145-5p模擬物組的熒光素酶活性(0.89±0.56)顯著高于陰性對照組(0.27±0.37，P<0.05)；而pGLO-RAD18-mut組中，miR-145-5p模擬物組(0.86±0.47)與陰性對照組(0.84±0.45)間熒光素酶活性的差異無統計學意義(P>0.05)，提示RAD18是miR-145-5p的靶基因。轉染48 h后，與陰性對照組〔13.45±3.54(-log)〕相比，miR-145-5p模擬物組RAD18〔7.04±1.67(-log)〕的mRNA水平明顯降低，miR-145-5p抑制劑組RAD18〔18.98±4.33(-log)〕的mRNA水平明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖3 miR-145-5p靶基因的預測

2.4 miR-145-5p對替莫唑胺誘導U87MG細胞凋亡的影響 與陰性對照組〔(5.19±0.32)%〕相比，替莫唑胺組〔(19.53±0.90)%〕、miR-145-5p模擬物組〔(17.32±0.77)%〕和替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組〔(36.19±2.06)%〕細胞凋亡能力均顯著提高(P<0.05)，且替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組細胞凋亡能力顯著高于替莫唑胺組和miR-145-5p模擬物組(P<0.05)，而替莫唑胺組和miR-145-5p模擬物組間差異無統計學意義(P>0.05)。與陰性對照組(RAD18：1.74±0.15，Bcl-2：1.35±0.11，Caspase：1.28±0.11)相比，替莫唑胺組(RAD18：0.83±0.10，Bcl-2：0.79±0.08，Caspase：2.15±0.15)、miR-145-5p模擬物組(RAD18：1.41±0.11，Bcl-2：1.02±0.09，Caspase：1.59±0.13)和替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組(RAD18：0.62±0.07，Bcl-2：0.83±0.08，Caspase：3.97±0.24)的Caspase蛋白顯著增高，RAD18和Bcl-2蛋白顯著降低(P<0.05)；miR-145-5p抑制劑組(RAD18：4.32±0.36，Bcl-2：5.11±0.42，Caspase：0.54±0.06)Caspase蛋白顯著降低，RAD18和Bcl-2蛋白顯著增高(P<0.05)，見圖4。

1～5：陰性對照組、miR-145-5p模擬物組、替莫唑胺組、miR-145-5p抑制劑組、替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組圖4 miR-145-5p對替莫唑胺誘導U87MG細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.5 miR-145-5p對替莫唑胺在裸鼠體內化療敏感性的影響 與陰性對照組〔(2.45±0.33)g〕相比，單獨注射替莫唑胺組〔(1.73±0.22)g〕、miR-145-5p組〔(1.91±0.25)g〕及替莫唑胺+miR-145-5p組〔(0.93±0.15)g〕裸鼠的腫瘤質量顯著降低，且替莫唑胺+miR-145-5p組的腫瘤質量顯著低于替莫唑胺組與miR-145-5p組(P<0.05)。

3 討 論

越來越多miR與腫瘤相關的研究表明，miR在調節腫瘤細胞對化療藥物敏感性和耐藥性方面發揮重要作用〔8,9〕。此前報道指出，miR-145-5p參與乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的發生并被視為腦膠質瘤的腫瘤抑制因子〔7,10〕。最近的證據表明miR-145-5p可通過下調TPT1使泌乳素瘤對溴隱亭的敏感性增加〔11〕。然而，關于miR-145-5p在腦膠質瘤細胞對替莫唑胺化療藥物敏感性的影響尚未見報道。本研究結果提示，miR-145-5p低表達與腦膠質瘤患者的預后不良相關，且可能與替莫唑胺耐藥相關。進一步分析提示，上調miR-145-5p可以增加腦膠質瘤U87MG細胞對替莫唑胺的化學敏感性。前期研究證實，RAD18可通過下調p53表達，誘導膠質瘤對放射治療產生抵抗〔12〕。本研究結果表明miR-145-5p可作用于RAD18并抑制其表達。鑒于 RAD18在前期研究中被證實可使FANCD2和PCNA蛋白的泛素化水平降低，并可抑制細胞凋亡〔13〕，本研究結果與前期研究相一致，表明miR-145-5p可通過抑制RAD18表達，調控凋亡相關蛋白Bcl-2與Caspase的表達水平，進一步促進細胞凋亡，并增加膠質瘤對替莫唑胺的敏感性。本研究尚有以下不足之處：①本研究收集的樣本數量有限，且樣本都來源于本院，這可能會使結果產生一定偏移，未來還需更多大樣本多中心的研究對本次研究的結果進行驗證；②本研究使用U87MG而非腦膠質瘤原代細胞，相比之下，原代細胞最大程度地保留了膠質瘤的腫瘤特性，可使結果的可信度進一步提高，因此，未來可使用腦膠質瘤原代細胞對本次實驗結果進行驗證。綜上，本研究首次就miR-145-5p調控替莫唑胺治療腦膠質瘤的潛在機制進行探究，并發現miR-145-5p可通過靶向抑制RAD18蛋白表達，進一步促進膠質瘤細胞凋亡，從而增加膠質瘤對替莫唑胺的敏感性。這些研究結果有望為腦膠質瘤的臨床治療提供新思路。