高密度脂蛋白模擬肽修復腫瘤壞死因子α誘導的內皮祖細胞損傷

王鳳嬌 高翔 孔淑琦 張建林 劉祺 尹航 王夢潔 王曉丹 牟青杰 楊娜娜

(1濰坊醫學院醫學研究實驗中心，山東 濰坊 261000；2泰山醫學院；3泰安市中心醫院)

動脈粥樣硬化患者循環內皮祖細胞(EPCs)較健康人明顯下降〔1〕，并且EPCs增生、遷移、成血管等功能受損〔2～4〕。進一步研究發現，心腦血管疾病EPCs數量和功能與炎癥等眾多危險因子成負相關關系〔4〕，例如腫瘤壞死因子(TNF)-α。TNF-α是冠心病的獨立危險因素之一〔5〕，能預測冠狀動脈粥樣硬化斑塊的穩定性及急性冠狀動脈綜合征的嚴重程度〔6〕，并且明顯損傷EPCs的功能〔7〕，因此如何提高心血管疾病患者EPCs功能，修復損傷血管內膜是心血管疾病前期預防和治療的關鍵之一。本課題組前期研究發現，高脂飲食小鼠體內血漿TNF-α水平與體內循環EPCs數量呈負相關，且顯著損傷EPCs增殖、遷移和成血管功能，高密度脂蛋白模擬肽(Rev-D4F)能顯著改善TNF-α誘導的上述損傷作用〔8〕。然而Rev-D4F是否對TNF-α誘導EPCs凋亡和黏附功能的損傷具有修復作用并不清楚。本實驗通過提前用Rev-D4F干預EPCs 6 h，觀察Rev-D4F是否能抑制TNF-α誘導EPCs的凋亡，并修復TNF-α誘導EPCs黏附功能的損傷。

1 材料與方法

1.1 EPCs分離 4～6周齡C57小鼠麻醉后脫臼處死，75%乙醇浸泡后取股骨，用M199培養液沖洗骨髓腔，反復吹打直至沖洗液清亮，濾網過濾后沖洗液與 Ficoll分離液的體積比為1∶1，室溫2 000 r/ min離心20 min，輕輕吸取中間乳白色云霧狀細胞層到新的離心管中，M199清洗沉淀細胞2次，完全培養液重懸細胞，按 106/cm2的密度接種在包被Fibronectin的培養瓶中，每3 d更換條件培養基 EGM-2MV〔9〕。

1.2 EPCs鑒定EPCs 在37℃與 2.5 mg/L的DiI-acLDL孵育2 h，多聚甲醛固定后，與10 mg/L的荊豆凝集素(FITC-UEA)于37℃孵育1 h，中性甘油封片，用熒光顯微鏡觀察。

1.3 實驗分組 培養的晚期EPCs分為三組：①對照組：含5%血清的M199培養基；②TNF-α組：用含5%血清的M199培養基配置的30 ng/ml TNF-α溶液；③Rev-D4F組：用含5%血清的M199培養基配置的50 μg/ml Rev-D4F溶液干預細胞6 h后，用含5%血清的M199培養基配置的30 ng/ml TNF-α溶液處理細胞。

1.4 黏附功能檢測 不同組別EPCs胰酶消化后接種于96孔培養板中，孵育 30 min，PBS 沖洗 3 次，每孔隨機取 5 個視野(× 40)計數。

1.5 凋亡檢測 胰酶消化細胞，1 200 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞兩次，加入5 μl Annexin V-FITC，孵育10 min，加入5 μl碘化丙啶(PI)孵育5 min，加入400 μl PBS上機檢測。

1.6 統計學分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1 EPCs型態和鑒定 根據本課題組前期對小鼠骨髓EPCs培養條件研究，采用3 d貼壁細胞繼續培養，培養10 d發現克隆，繼續傳代培養20 d呈長梭形。見圖1。培養14 d細胞進行吸附低密度脂蛋白和結合凝集素實驗發現，約70%細胞能吸附低密度脂蛋白并結合凝集素(見圖2)，為正在分化的EPCs。

2.2 Rev-D4F對TNF-α誘導EPCs凋亡的影響 與對照組〔凋亡率(7.9±0.33)%〕相比，TNF-α組顯著促進EPCs凋亡〔凋亡率(29.7±0.75)%〕，提前6 h加入50 μg/ml Rev-D4F顯著抑制TNF-α誘導的EPCs凋亡〔凋亡率(17.6±1.41)%〕，見圖3。

圖1 小鼠骨髓單個核細胞不同培養時間EPCs型態(×40)

圖2 EPCs鑒定(×40)

圖3 Rev-D4F抑制TNF-α誘導的EPCs凋亡

2.3 Rev-D4F提高EPCs黏附功能 根據前期研究結果，選取了TNF-α和Rev-D4F的劑量分別為30 ng/ml和50 μg/ml〔8〕。黏附功能檢測發現，TNF-α對EPCs黏附功能并無顯著影響〔TNF-α組黏附細胞數(6.9±0.83)個，對照組(6.8±0.72)個〕，Rev-D4F三組提前6 h加入50 μg/ml Rev-D4F的EPCs能顯著提高EPCs的黏附功能〔(8.8±0.72)個〕。

3 討 論

多項研究表明，體內循環中EPC數量的減少不僅與內皮功能降低有關〔4〕，而且與心血管疾病〔10,11〕、側支形成減少〔12〕和加重心血管疾病的進程有關〔13〕。而自體EPCs移植由于存在本身功能缺陷等問題，阻礙了自體細胞治療心血管疾病的應用，因此，EPCs移植前后的藥物調節可能是提高其治療心血管疾病潛能的一種新方法〔14〕。

Rev-D4F是一種改良的D4F，它通過抑制內皮炎癥和改善高密度脂蛋白功能，降低主動脈竇動脈粥樣硬化病變面積〔15〕。前期發現Rev-D4F通過磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶/內皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)途徑改善小鼠骨髓來源的EPC功能，對TNF-α誘導的小鼠骨髓來源的EPC增殖、遷移和成血管功能損傷具有修復作用〔8〕，本實驗前期研究基礎上，繼續研究Rev-D4F對TNF-α誘導的小鼠骨髓來源的EPC黏附功能和凋亡的影響。結果發現，TNF-α(30 ng/ml)促進EPCs凋亡，但TNF-α(30 ng/ml)對EPCs黏附并沒有作用，Rev-D4F預先干預能明顯抑制TNF-α誘導的EPCs凋亡，提高EPCs黏附功能。