白花蛇舌草誘導白血病CEM細胞凋亡的分子機制

朱大誠 徐麗婷 況東 潘榮斌

(江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

白花蛇舌草(HDW)是茜草科植物，又名蛇舌草、鶴舌草、蛇針草、蛇總管、羊須草、龍舌草等。最早記載于《新修本草》第廿卷中，取名“蛇舌”。白花蛇舌草味苦、甘，性寒，歸心、肝、脾經，其功效為清熱解毒、利尿消腫，目前藥理研究表明白花蛇舌草具有良好的抗菌消炎、抗腫瘤、調節免疫、抗化學誘變、保肝利膽等作用〔1〕。白花蛇舌草抗腫瘤作用的研究非常廣泛，且多為實體瘤，但對白血病作用的研究較少〔2,3〕。前期研究〔4,5〕證明HDW能夠誘導白血病CEM細胞凋亡，本實驗基于細胞凋亡信號通路理論，探討HDW是否能夠通過調控細胞凋亡信號通路-死亡受體途徑中相關信號分子的表達而實現誘導CEM細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞株 白血病CEM細胞株于2006年購自中國醫學科學院天津血液病研究所，并長期保存于本研究室液氮中。

1.2 藥物與試劑 HDW為江西藥都樟樹中藥飲片有限公司產品(批號:2016091212)。RPMI1640培養基為賽默飛世爾生物化學制品有限公司生產；胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司生產；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、caspase8、caspase9分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；抗caspase3(ab32351)、抗caspase8(ab32125)購自Abcam；β-actin(3457P)購自美國CST公司；山羊抗兔(CW0103)購自高靈敏度化學發光檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(上海立申科學儀器有限公司)、CO2培養箱(型號3111，美國ThermoForma公司)、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)、去離子純水機(SMART-Q15UT，上海和泰儀器有限公司)、多功能酶標儀(Varioskan Flash，Thermo Fisher,芬蘭)、通用電泳儀(美國Bio-Rad公司)、凝膠成像系統(美國Protein Simple公司)。

1.4 方法

1.4.1 HDW水提取物的制備 HDW水提取物的制備按照參考文獻〔4〕報道的方法進行提取得到HDW粉末,臨用前采用滅菌三蒸水配成濃度為16.6 mg/ml的HDW水提取液。

1.4.2 凋亡酶活性測定 取對數生長期CEM細胞，用含10%血清的RPMI1640培養基調細胞密度為3×105個/ml，按每瓶14.25 ml細胞懸液分瓶，共12瓶；培養24 h后，分成12、24、36 h 3組，每組4瓶，設定HDW水提物3個濃度組〔每瓶分別加入750 μl HDW水提物，使終濃度分別為6.64 μg/ml(HDW 1組)、33.20 μg/ml(HDW 2組)、166.00 μg/ml(HDW 3組)〕和一個對照組(加入750 μl滅菌三蒸水)。加藥后繼續培養，分別于12、24、36 h提取作用相應時間的蛋白，用BCA蛋白試劑盒測定并計算蛋白濃度。根據分光光度法檢測試劑盒說明書進行操作，檢測凋亡酶caspase3、caspase8、caspase9的活性。

1.4.3 凋亡酶蛋白的檢測 細胞培養、實驗細胞密度、分瓶(分組)及細胞數量、藥物濃度等同實驗方法1.4.2。加藥繼續培養，分別于6、12、24 h提取相應時間蛋白，用BCA蛋白試劑盒測定蛋白含量并計算蛋白濃度，得出相應上樣量，進行免疫印跡實驗。應用Alpha View SA軟件對免疫印跡實驗得到的條帶進行分析，以β-actin作為內參，目的蛋白灰度值/內參灰度值即為目的蛋白的半定量表達。

1.5 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1 凋亡酶的活性 HDW 1、2、3組caspase3、caspase8活性表達量A值明顯高于對照組(P<0.05)，在同一時間，隨HDW水提物濃度增加，caspase3、caspase8的活性表達量也隨之增強(P<0.05)；對于同一HDW濃度，caspase3、caspase8的活性在24 h時最大，其后酶活性開始逐漸下降(P<0.05)。caspase9活性表達A值隨時間、藥物濃度的變化沒有明顯改變，與對照組比也沒有統計學意義(P>0.05)。見表1～3。

表1 HDW水提物對caspase3活性的影響(A值，

與對照組比較：1)P<0.05；與HDW 1組比較：2)P<0.05；與HDW 2組比較：3)P<0.05；與12 h比較：3)P<0.05；與24 h比較：4)P<0.05；表2、3同

表2 HDW水提物對caspase8活性的影響(A值，

表3 HDW水提物對caspase9活性的影響(A值，

2.2 caspase3、caspase8蛋白的表達 隨藥物濃度的增加和作用時間的延長，凋亡酶蛋白caspase3、caspase8的表達與內參β-actin的比值與對照組比較逐漸增大，表明caspase3、caspase8蛋白的表達呈上升趨勢，且與對照組比較差異有顯著意義(P<0.05)。見圖1，表4。

1～4：對照組、HDW 1組、HDW 2組、HDW 3組

表4 HDW水提取物對caspase3、caspase8蛋白表達的影響

與6 h比較：1)P<0.05；與12 h比較：2)P<0.05；與對照組比較：3)P<0.05；與HDW 1組比較：4)P<0.05；與HDW 2組比較：5)P<0.05

3 討 論

腫瘤細胞凋亡受阻是導致腫瘤的快速生長和治療困難的主要原因。細胞凋亡信號通路主要包括3條途徑，即線粒體途徑、內質網途徑及死亡受體途徑，這3條途徑之間相互聯系，并交匯于下游的凋亡酶蛋白caspase3。線粒體途徑可由外界的刺激釋放細胞色素C后引起一系列的反應。內質網途徑主要包括應激活化蛋白激酶(JNK)、增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)和caspase信號通路。死亡受體途徑是指通過特定的死亡配體與細胞膜上相應的死亡受體結合、相互作用而介導，從而激活細胞內的凋亡酶caspase：起始酶caspase8激活caspase3；或者切割B淋巴細胞瘤家族成員中的B淋巴細胞瘤2基因抑制性含bh3結構域蛋白引起線粒體釋放細胞色素c，增強caspase9的表達使caspase3活化，進而引起凋亡酶caspase的級聯反應，從而導致細胞凋亡的一條信號通路〔6,7〕。

本實驗說明24 h之前caspase3、caspase8的活性逐漸增強，而在24 h之后此兩種酶的活性可能開始下降。細胞凋亡信號通路中，其中凋亡酶caspase8是死亡受體途徑的關鍵酶；凋亡酶caspase9既是線粒體途徑的關鍵酶，又是死亡受體途徑的關鍵酶；內質網途徑的關鍵酶是caspase12；而凋亡酶caspase3是3條凋亡路徑的共同交匯點〔6〕。本實驗推測HDW水提物誘導CEM細胞凋亡，可能不是通過線粒體途徑來實現的。HDW可能是通過調控細胞凋亡信號通路中死亡受體途徑的特定死亡配體與細胞膜表面的相應死亡受體結合，從而激活胞內的凋亡酶caspase8的活性，級聯反應升高凋亡酶caspase3的活性而導致白血病CEM細胞凋亡。內質網途徑是否介導了這一作用還有待于深入研究。