靶向APE/Ref-1基因沉默及過表達對MRC-5細胞氧化損傷的影響

王鑰 張慧明 劉天睿 范采蕭 熊健良 陳玨曉 張鵬霞

(佳木斯大學 1臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2基礎醫學院)

衰老是導致人類疾病的最大危險因子，多種慢性病、退行性疾病產生的重要原因就是氧化損傷與氧化應激。隨著人體衰老，機體活性氧(ROS)大量積聚，導致氧化應激。因此，找出體內干預氧化應激過程的細胞分子生物學指標，增強細胞抗氧化能力，延緩機體衰老，對于慢性疾病的防治具有十分重要的研究價值。人類脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子(APE/Ref)-1是一類分布廣泛的生物大分子蛋白質，可控制細胞分化、凋亡和增殖，調控轉錄因子和氧化還原狀態〔1,2〕;作為核酸內切酶它可以切除修復ROS引起的損傷的DNA堿基，治療ROS引起的氧化應激損傷。細胞核內該基因的高表達有助于修復并減少DNA損傷。當前，在抗腫瘤藥物開發方面對APE/Ref-1的研究已獲得了許多新的研究進展〔3〕，而該基因對氧化損傷的人胚肺成纖維細胞MRC-5細胞的影響還未見報道。有文獻表明，棉酚對APE/Ref-1基因表達有抑制作用〔4〕，黃芪多糖對APE/Ref-1基因表達有促進作用〔5〕。本研究分別用黃芪多糖和棉酚使MRC-5細胞的APE/Ref-1基因表達上調和下調，驗證APE/Ref-1基因對MRC-5細胞氧化損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 MRC-5細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)為HyClone公司產品；CCK-8、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶購自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、四甲基乙二酸(TEMED)、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺為Amresco公司產品；小鼠抗人 8-羥基-2′脫氧鳥苷(8-OHd G)抗體為Santa Cruz公司產品；FITC標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G、β-肌動蛋白(actin)和APE/Ref-1單克隆抗體為武漢博士德生物公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和處理 在DMEM培養液(含100 μg/ml鏈霉素、100 ml滅活FBS和100 IU/ml青霉素)中培養MRC-5細胞，于50 ml/L CO2、37℃、濕度適合的孵育箱中常規培養。細胞單層貼壁生長到70%～80%時，用2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶3比例分瓶傳代培養，以下實驗選取處于對數生長期的MRC-5細胞。

1.2.2 藥物濃度的選擇 取對數生長期的MRC-5細胞分別設計三組藥物濃度，每組設4個復孔，在96孔板中接種，每孔接種5×103個細胞、200 μl培養液。用CCK-8法測細胞活力：丟棄孔內培養液，每孔加入CCK-8培養液(CCK-8液∶培養液=1∶9，實驗前配好，現用現配混勻后加入孔中)100 μl，孵育1～4 h，酶標儀測OD值。實驗均重復三次，結果取平均值。細胞增殖抑制率=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。選擇最適藥物濃度用于以下實驗。

1.2.2.1 過氧化氫(H2O2)處理MRC-5細胞產生氧化損傷 應用3% H2O2(8.89 mol/L)，濃度分別為400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200 μmol/L，在孵育24 h后，棄原培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，換成指定H2O2濃度的培養液(空白對照組和對照組換新培養基)，孵育24 h，CCK-8檢測細胞活力。

1.2.2.2 棉酚抑制MRC-5細胞APE/Ref-1基因的表達 空白組：無細胞的完全培養基；對照組：完全培養液和細胞；H2O2模型組：細胞用終濃度為 700 μmol/L的H2O2完全培養液；棉酚處理組：將20 mg棉酚溶解，制成濃度40 mg/ml的溶液，設計濃度分別為 30、25、20、15、10 μmol/L，種板孵育24 h后，H2O2模型組和棉酚處理組加700 μmol/L H2O2處理8 h后，棉酚處理組按濃度換培養液，空白組與對照組更換新培養液，H2O2模型組更換700 μmol/L的H2O2完全培養液，孵育24 h。CCK-8檢測。

1.2.2.3 黃芪多糖促進MRC-5細胞APE/Ref-1基因表達 空白組、對照組、H2O2模型組處理方法同“1.2.2.2”，黃芪多糖處理組：將20 mg黃芪多糖溶解，制成濃度為20 mg/ml溶液，設計濃度梯度為100、200、400、800 mg/L。種板后孵育24 h，H2O2模型組和黃芪多糖處理組用700 μmol/L的H2O2處理8 h，黃芪多糖處理組按濃度換培養液，其他組同“1.2.2.2”更換新培養液，培養24 h。CCK-8檢測。

1.2.3 CCK-8法檢測各組細胞活力 對照組：含完全培養液和細胞；H2O2模型組：細胞和完全培養基培養24 h后換為終濃度為700 μmol/L的H2O2；棉酚處理組：細胞和完全培養基培養24 h后換為終濃度為700 μmol/L的H2O2處理8 h后換為終濃度為20 μmol/L的棉酚；黃芪多糖處理組：細胞和完全培養基培養24 h后換為終濃度為700 μmol/L的H2O2處理8 h后換為終濃度為200 μmol/L的黃芪多糖。CCK-8檢測。

1.2.4 Western印跡檢測APE/Ref-1蛋白表達情況 實驗設計細胞分組及內容同“1.2.3”。細胞接種于12孔板中，每組設3復孔，每孔加約105個細胞，500 μl培養液。培養24 h后棄培養液，用預冷的PBS洗3次，加入蛋白裂解液〔含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)、10%蛋白抑制劑〕冰上靜置10 min后，在冰上反復吹打，用槍頭刮下并吸取至做好標記的EP管中，置低溫離心機于12 000 r/min、4℃，離心10 min，取上清液至新的EP管，勿吸取白色黏稠物，加入5倍的上樣緩沖液，混勻，煮沸10 min，電泳(80 V、30 min，110 V、1 h)，按目的蛋白和內參大小截取膠條，轉膜。用濃度為5%的脫脂奶粉封閉1 h后，使用β-actin和APE/Ref-1的單克隆抗體，4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次取出膜，室溫下敷二抗1 h，TBST洗滌3次，ECL化學發光法進行照相。

1.2.5 免疫熒光細胞化學檢測8-OHd G表達 實驗設計分為對照組、H2O2模型組、棉酚處理組、黃芪多糖處理組，在每組細胞爬片之后，用丙酮處理固定15 min，加 BSA 封閉液，置于37℃ 水浴孵育1 h，加小鼠抗人8-OHd G抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；37℃復溫1 h，PBS洗滌3次；加FITC標記的山羊抗小鼠IgG，37℃避光孵育2 h；用PBS沖洗每次5 min，3次，封片鏡檢計數。

1.3 統計學分析 應用Graphpad統計軟件行方差分析，組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 CCK-8測定結果

2.1.1 H2O2對MRC-5細胞的損傷作用 與對照組(抑制率為0)比較，H2O2導致的細胞損傷有濃度依賴性，且呈正比關系。H2O2濃度為400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200 μmol/L時，細胞增殖抑制率分別為(5.2±1.1)%，(10.1±2.4)%，(19.9±4.3)%，(30.7±10.7)%，(50.3±1.1)%，(71.8±4.6)%，(81.9±1.2)%，(84.9±0.7)%，(86.9±0.9)%。由此，本實驗建立MRC-5氧化損傷細胞模型時H2O2濃度為700 μmol/L。

2.1.2 黃芪多糖對MRC-5細胞增殖的影響 與H2O2模型組〔抑制率為(37.0±1.1)%〕相比，不同濃度的黃芪多糖都可降低細胞的增殖抑制率，100、200、400、800 mg/L黃芪多糖組細胞增殖抑制率分別為(17.4±1.4)%、(7.7±1.4)%、(23.9±1.7)%、(28.4±1.1)%。當黃芪多糖濃度為200 mg/L處理 MRC-5細胞時，細胞活性最高，細胞增殖抑制率最低。由此，本實驗以200 mg/L的黃芪多糖建立MRC-5細胞APE/Ref-1基因表達上調模型。

2.1.3 棉酚對MRC-5細胞增殖的影響 與對照組(抑制率為0)和H2O2模型組〔抑制率為(32.9±6.4)%〕相比，不同濃度下的棉酚對 MRC-5細胞生長均有抑制作用，抑制程度隨棉酚濃度升高而增強，棉酚濃度為10、15、20、25、30 μmol/L時MRC-5細胞增殖抑制率分別為：(30.4±6.5)%，(38.4±6.4)%，(48.4±3.8)%，(59.2±1.7)%，(66.1±3.8)%。本實驗以20 μmol/L的棉酚處理細胞，建立MRC-5細胞APE/Ref-1基因表達下調模型。

2.1.4 各實驗組MRC-5細胞存活率 在H2O2處理24 h后，細胞存活率為41.68%，而相同時間下用棉酚處理后，細胞存活率為15.89%，由引說明，棉酚降低了MRC-5細胞存活率(P<0.001)。同理，相同時間下用黃芪多糖處理后，細胞存活率為68.92%，說明黃芪多糖提升了MRC-5細胞存活率(P<0.001)。見表1。

表1 各組MRC-5細胞存活率(%，n=5)

與H2O2模型組比較：1)P<0.000 1

2.2 Western印跡檢測 與對照組(0.73±0.05)相比，棉酚處理組APE/Ref-1基因表達量(0.41±0.02)最少，H2O2模型組(0.48±0.03)多于棉酚組，黃芪多糖處理組APE/Ref-1基因表達量(0.77±0.05)接近對照組。見圖1。

2.3 免疫熒光細胞化學檢測8-OHd G表達 與對照組相比，H2O2模型組8-OHd G的表達明顯增高。與H2O2模型組相比，黃芪多糖處理組表達相對減少，棉酚處理組表達相對增多。見圖2。

圖1 Western印跡法檢測MRC-5細胞APE/Ref-1蛋白表達量

圖2 不同處理條件下的MRC-5 細胞 8-OHd G表達(熒光顯微鏡，×600)

3 討 論

APE/Ref-1是一類生物大分子蛋白質，存在于各種細胞中，有異質性，可有細胞核、細胞質、細胞核-質三種分布形式〔3〕。在其異常表達或者功能活性改變、分布改變時會導致細胞異常表現，使細胞凋亡，產生腫瘤、衰老等多種疾病反應，因此APE/Ref-1可能是抗氧化藥物的潛在靶點〔6，7〕。APE/Ref-1表達的位置變化和(或)高表達與許多惡性腫瘤如肺癌、胰腺癌等癌癥的發展和預后有著不可忽視的相關性〔8〕。有文獻指出減少細胞APE/Ref-1基因的表達，可以減輕肝細胞的氧化應激反應〔9〕。Biswas等〔10〕證明腫瘤內皮細胞nox-4衍生的H2O2使DNA氧化，誘導APE/Ref-1的表達；抑制APE/Ref-1表達使腫瘤體積減少50%，說明內皮細胞腫瘤的增殖依賴于APE/Ref-1的表達。異常細胞質APE/Ref-1與高級卵巢漿液腺癌的進展和化學抗性有關，預后不良〔11〕。APE/Ref-1介導的SIPR1過表達可能與AngⅡ 引起的血管功能障礙有關〔12〕。Chantre-Justino 等〔13〕發現在膀胱癌晚期患者中，APE/Ref-1等 DNA 修復酶水平高于早期患者，能修復其過剩的氧化應激損傷，促進腫瘤發展。APE/Ref-1基因高表達，能夠增強細胞對H2O2、博萊霉素等的抵御能力〔14〕。局灶性腦缺血時存在DNA氧化損傷，且可檢測到APE/Ref-1表達下調，導致無法修復損傷DNA，誘導細胞凋亡〔15〕。以上研究都表明，APE/Ref-1高表達可提高細胞活性，抑制細胞凋亡。APE/Ref-1的過表達或其表達部位改變在許多疾病中起著重要的作用。因此，研究機體內APE/Ref-1的表達或探討其活性的改變可減緩機體內的氧化損傷，也有利于對此類疾病的預防和治療，在特定部位抑制APE/Ref-1的表達可減緩腫瘤的發生。

機體內自由基的形成會引起氧化損傷從而導致腦動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、腦缺血等疾病，這類疾病產生的根本原因是氧化應激與過氧化物的堆積。事實上，身體本身存在去除和修復氧化損傷的能力。如抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)等可清除體內的自由基；DNA受到損傷時，APE/Ref-1可以作為抗氧化酶起關鍵作用，切除或修復損傷的DNA片段。有報道表明，大腦暫時性缺血6 h，腦內對缺血有抵抗能力的齒狀回顆粒細胞中該基因表達增加〔16〕；APE/Ref-1高水平表達有助于細胞抗缺氧損傷，而低表達APE/Ref-1細胞在缺氧狀態下增加了死亡率〔17〕。可見，APE/Ref-1對細胞維持生存及發揮功能有著重要作用。另據報道，APE/Ref-1可能具有減弱H2O2引起大鼠PMVECs產生氧化應激反應的作用〔18〕。APE/Ref-1基因敲除的小鼠在胚胎E3.5 d即死亡〔5〕。以上研究均提示，細胞中的APE/Ref-1表達下降時，細胞產生氧化損傷甚至死亡。但目前以APE/Ref-1為目標靶點研究氧化損傷性疾病的防治卻很少。以APE/Ref-1為靶點定向提高其蛋白表達，或者當機體產生氧化損傷時減少、抑制其表達下調可防治氧化損傷性疾病，這對此類疾病的研究將具有重要的科學意義。

大量實驗表明，氧化損傷可以導致細胞衰老〔19〕。細胞受到氧化損傷時出現細胞增殖抑制、周期阻滯〔20〕導致細胞衰老及死亡。H2O2是產生ROS的主要形式，H2O2對細胞作用迅速，誘導缺氧效果顯著，該效果在一定范圍內與濃度呈正比。它易于穿過細胞膜，在短期內引發細胞產生各種ROS，迅速引起細胞內物質過氧化、細胞功能紊亂、膜通透性增加甚至死亡〔21〕。因此，本實驗選用H2O2處理細胞，建立衰老損傷模型，模擬細胞氧化損傷。

本研究發現，棉酚可抑制MRC-5細胞APE/Ref-1基因的表達；黃芪多糖可促進MRC-5細胞APE/Ref-1基因的表達；低表達APE/Ref-1基因的MRC-5細胞存活率低，高表達APE/Ref-1基因的MRC-5細胞存活率高；APE/Ref-1表達增加可降低MRC-5細胞 8-OHd G的含量。氧化損傷的MRC-5細胞，APE/Ref-1基因高表達可以減弱MRC-5細胞的氧化損傷并抑制其凋亡。因此，靶向APE/Ref-1可以作為預防和治療氧化損傷的研究新方向，為氧化損傷性疾病、退行性疾病、腫瘤發生的階段及預后和治療提供新的靶點，指出了研究的新思路。