ku80蛋白表達水平與肝癌細胞侵襲遷移能力的相關性

王寧 張帥民 王常元 徐賢剛 黎濤 王飛清 李克躍 劉振華

(1貴州省骨科醫(yī)院藥劑科，貴州 貴陽 550002；2貴州大學附屬人民醫(yī)院肝膽外科；3貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科)

原發(fā)性肝癌(PHC)是全世界最常見、排名第六位的癌癥，也是癌癥相關死亡的第四大常見原因〔1〕。肝癌術后常出現(xiàn)轉移、復發(fā)，成為其高死亡率的主要原因之一，雖治療手段取得了極大進步，但其療效仍不理想〔1,2〕。根本原因是缺乏防治肝癌轉移復發(fā)的有效手段及確切的治療靶標〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)ku80蛋白在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤細胞黏附、遷移及侵襲中發(fā)揮重要作用〔4～6〕，然而其在肝癌細胞系中表達、表達部位與肝癌細胞系的遷移、侵襲能力是否具有相關性仍不清楚。本文擬分析ku80蛋白表達水平與肝癌細胞侵襲遷移能力的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常人肝細胞HL-7702購于中國科學院上海生命科學院細胞庫，兔ku80單克隆抗體(EPR3467)、羊抗兔Alexafluor?488熒光標記二抗均購于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。ku80引物由上海吉瑪生物技術公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2、HL-7702使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2孵箱中孵育，每2 d換培養(yǎng)基一次，細胞密度達到80%，進行后續(xù)實驗的處理。

1.2.2 Western印跡檢測蛋白水平 冰上裂解細胞30 min，收集裂解細胞懸液至1.5 ml離心管，14 000 r/min，4℃ 離心20 min。二喹啉甲酸(BCA)法定量各組樣品蛋白，用上樣緩沖液進行樣品制備，上樣行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉法轉印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉常溫下封閉2 h，4℃冰箱中一抗孵育過夜，洗膜液洗3次，每次10 min，用二抗室溫孵育1.5 h，進行化學發(fā)光顯色，化學發(fā)光及凝膠成像儀觀察各組細胞ku80蛋白水平。

1.2.3 Real-time(RT)PCR 提取各細胞系RNA，并使用M-MLV逆轉錄酶系統(tǒng)進行逆轉錄。 篩選最有效的ku80引物序列為5′-TGACTTCCTGGATGCACTAATCGT-3′(正義鏈);5′-TTGGAGCCAATGGTCAGTCG-3′(反義鏈)。內(nèi)參β-actin正義鏈：5′-GGCGGCACCATGTACCCT-3′;反義鏈：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。LightCycler 480儀用于PCR(先95℃ 30 s，然后94℃ 30 s、30℃ 60 s、72℃ 30 s)，進行45個循環(huán)。72℃延伸7 min，PCR在4℃終止。 使用LightCycler 480軟件1.5分析mRNA表達作為校準物標準化比率。預實驗驗證目的基因擴增效率與內(nèi)參一致。

1.2.4 細胞劃痕實驗 待細胞生長至最佳，每孔3×105個/ml細胞接種于6孔板，次日長滿后，用20 μl的加樣槍頭輕輕劃一痕，0 h、72 h時間點測量劃痕寬度算出細胞遷移率。

1.2.5 細胞侵襲實驗 Transwell小室上層采用Matrigel膠與減血清培養(yǎng)基按1∶6比例混合，每孔100 μl鋪成單層，37℃溫箱孵育30 min； 每孔5×105個/ml，取300 μl細胞懸液接種于Transwell小室，置于24孔板中，下室加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽在小室內(nèi)層輕輕擦試膠，蘇木素染色10 min，伊紅紫染色8 min，75%酒精洗2次，每次2 min。隨機取5個視野，計數(shù)細胞穿膜數(shù)。

1.2.6 免疫熒光檢測亞細胞定位 將爬好細胞的

玻片在培養(yǎng)板中用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗細胞3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定細胞15 min。用PBS(含0.2% 曲拉通X-100)通透20 min。以山羊血清非特異性封閉1 h。室溫下ku80一抗在濕盒中孵育2 h。二抗避光孵育細胞1 h。DAPI復染細胞5 min。PBS漂洗細胞后熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計處理 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，行直線相關性分析。

2 結 果

2.1 ku80 mRNA在各細胞系中的表達水平 ku80 mRNA在HL-7702和3株肝癌細胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2中均可檢測到，并且3株肝癌細胞ku80 mRNA水平明顯高于正常肝細胞HL-7702(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2 ku80蛋白在各細胞系中的表達 ku80蛋白在正常肝細胞及3株肝癌細胞中均有表達，且相比正常肝細胞HL-7702,各肝癌細胞系ku80蛋白的表達升高明顯(P<0.05)，其中在MHCC97-H細胞中表達量最高(P<0.01)(圖1，表1)。

圖1 ku80蛋白在各細胞系中的表達

表1 各細胞系ku80的表達水平及侵襲遷移能力

與HL-7702比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 肝癌細胞體外遷移能力 相比正常肝細胞HL-7702,各肝癌細胞系具有明顯遷移能力(P<0.05)，其中MHCC97-H細胞在同時間內(nèi)遷移率與正常肝細胞比較差異更顯著(P<0.01)(表1，圖2)。

2.4 肝癌細胞體外侵襲能力 各細胞系均有不同程度侵襲能力。與正常肝細胞HL-7702相比，MHCC97-L、HepG2肝癌細胞系的穿膜細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MHCC97-H細胞穿膜細胞數(shù)差異更顯著(P<0.01)(表1，圖3)。

2.5 ku80蛋白亞細胞定位 通過免疫熒光技術檢測MHCC97-H細胞中ku80的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，綠色標記的ku80蛋白主要在細胞核中表達，在細胞質(zhì)中亦有散在分布(圖4)。

2.6 ku80蛋白、mRNA表達量與肝癌細胞系遷移、侵襲能力的相關性分析 ku80蛋白水平與肝癌細胞的遷移、侵襲能力呈正相關(r=0.83，F(xiàn)=50.03，P<0.01；r=0.94，F(xiàn)=159.70，P<0.01)；ku80 mRNA的表達水平亦與肝癌細胞系的遷移、侵襲性呈正相關(r=0.86，F(xiàn)=61.49，P<0.01；r=0.87，F(xiàn)=69.18，P<0.01)(圖5)。

圖2 肝癌細胞遷移能力(×40)

圖3 肝癌細胞侵襲能力(×100)

圖4 MHCC97-H細胞ku80免疫熒光亞細胞定位

圖5 ku80蛋白、mRNA表達水平與肝癌細胞系遷移、侵襲能力的相關性

3 討 論

肝細胞性肝癌(HCC)往往合并肝硬化，對肝硬化患者進行規(guī)律的超聲篩查可以有效地發(fā)現(xiàn)早期肝癌并有益于提高生存率〔7,8〕。外科治療如肝葉切除、肝移植、射頻消融、介入栓塞的治療有其各自的適應證與局限性。研究發(fā)現(xiàn)輔以中醫(yī)中藥治療亦可收到一定效果〔9〕，索拉非尼一定程度上能使晚期肝癌患者的生存獲益〔10〕。然而，探索有效的治療藥物靶點，達到精準治療，防治肝癌轉移、復發(fā)是目前面臨的重要難題。

ku80是ku蛋白復合物的一個亞基，ku蛋白家族是在原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)的豐富、高度保守的DNA結合蛋白，在維持基因組完整性中起重要作用〔11〕。ku80蛋白由XRCC5基因編碼，與 ku70共同構成ku70/ku80異源二聚體，是一種DNA依賴性蛋白激酶復合物(DNA-PK)。ku80蛋白的顯著特征在于其作為“經(jīng)典”非同源末端連接(C-NHEJ)途徑中的初始DNA末端結合因子發(fā)揮中心作用，直接或間接地與幾種非同源末端連接因子和加工酶相互作用，作為整個DNA修復復合物的支架參與DNA雙鏈斷裂修復〔12,13〕。還有證據(jù)表明ku參與DNA損傷應答機制的信號傳導，以調(diào)節(jié)細胞周期檢查點的激活和細胞凋亡的激活〔14〕。

ku的功能對于維持基因組完整性和適當?shù)募毎蜕锇l(fā)育至關重要〔15〕。ku80作為ku發(fā)揮功能的重要亞基，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ku80在肺癌組織中過表達,在非小細胞肺癌細胞中，敲低ku80，可在體外和體內(nèi)抑制腫瘤特性〔16〕。肺腺癌的組織芯片免疫組織化學分析顯示ku80和環(huán)氧化酶(COX)-2水平與臨床病理特征之間存在強烈的正相關，ku80過度表達的肺癌患者預后不佳，ku80促進COX-2表達和腫瘤生長，并且可能是肺癌的潛在治療靶標〔17〕。既往研究表明，DNA雙鏈斷裂修復蛋白ku80對順鉑聯(lián)合放射治療宮頸癌亦具有增敏作用〔18〕。熱療作為抗癌方法受到越來越多的關注，ku80可能通過影響細胞周期分布在高溫誘導的腎癌細胞凋亡和熱敏感性中發(fā)揮重要作用〔19〕。在局部進展的食管癌研究中發(fā)現(xiàn)，高表達ku80往往預示著更差的預后〔20〕。

總之，ku80可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。ku80蛋白主要在細胞核表達，其表達水平與肝癌細胞系的遷移、侵襲能力呈正相關。鑒于ku80在腫瘤發(fā)展中的重要作用，有望成為肝癌的潛在治療靶標。