右美托咪定對多塞平誘導PC12細胞凋亡的影響

楚云超 黃科昌 王中偉 葛維鵬 杜梅青 林艷

(1東營市勝利油田中心醫院疼痛科，山東 東營 257034；2濰坊醫學院附屬醫院麻醉科)

多塞平局部應用時可產生較強的脊髓神經麻醉、外周神經阻滯作用，并且在神經病理性疼痛治療中發揮重要作用〔1～3〕。但以往的研究表明，鞘內應用多塞平在一定濃度范圍內有依賴性的神經細胞毒性〔4,5〕，并證實Caspase-3介導的細胞凋亡在多塞平誘導的神經細胞凋亡中具有一定作用〔6〕，線粒體途徑介導的而非死亡受體途徑介導的細胞凋亡可能是多塞平的脊髓神經毒性機制之一。右美托咪定作為具有鎮靜、鎮痛、抗焦慮、抑制交感神經興奮性及減少應激反應的高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，可加強局部麻醉藥脊髓麻醉和外周神經阻滯的效果〔7,8〕；另一方面，右美托咪定可抑制原代培養脊髓神經細胞凋亡和減少發育期大鼠脊髓神經細胞損傷〔9〕，但是，其對多塞平誘導的神經細胞凋亡是否也有保護作用，目前少見報道。本研究探討右美托咪定對多塞平致神經毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器 試劑:DMEM/F12培養基(Gibco，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；多塞平(Sigma，美國)；噻唑藍(MTT)檢測試劑(碧云天，中國江蘇南通)；右美托咪定(中國江蘇恒瑞醫藥有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(Invitrogen，美國)；PC12細胞(大鼠的腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞，購自中國上海市生命科學研究院細胞庫)。

主要儀器:酶標儀(賽默飛，中國)；光學倒置顯微鏡(Nikon，日本)；流式細胞儀(BD，美國)；細胞離心機(上海市安亭科學儀器有限公司，中國)；水平流超凈工作臺(無錫易純凈化設備有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 PC12細胞培養在含12%胎牛血清、100 U/ml青、鏈霉素的高糖DMEM培養基中，放置于5%CO2細胞培養箱中培養，培養箱溫度設置為37℃。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率 將PC12細胞接種于96孔培養板中，于5%CO2培養箱中培養，每孔加入約含5×105個細胞的200 μl細胞懸液，按20個孔接種。次日PC12細胞貼壁后分為4組，每組設置5個復孔。正常對照組PC12細胞不做任何處理；多塞平組PC12細胞加入多塞平，濃度為120 μmol/L；右美托咪定組加入右美托咪定，濃度為1 μmol/L，多塞平+左美托咪定組同時加入濃度為120 μmol/L的多塞平和1 μmol/L的右美托咪定。然后將PC12細胞放置于5% CO2培養箱繼續培養，溫度為37℃。處理培養24 h后向每孔中加入5 g/L MTT溶液20 μl，繼續培養4 h。去除培養液后，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩使結晶溶解后于酶標儀上測定各孔570 nm處的吸光度值。依據OD值計算細胞存活率(實驗組OD值/正常對照組OD值×100%)。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細胞形態、流式細胞儀檢測細胞凋亡率 處理細胞并使其濃度為(5～10)×105個/ml，以每孔2 ml將PC12細胞接種于12個孔中，分為兩組，每組設置3復孔，待PC12細胞貼壁后按照1.2.2的方式分組處理。24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態、貼壁狀況及細胞密度變化并拍照。吸去培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞2次，分別消化和收集各組細胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻細胞，室溫下避光孵育15 min。加入400 μl 1倍上樣緩沖液后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 MTT法檢測各細胞存活率 多塞平組、右美托咪定組、多塞平+右美托咪定組細胞存活率分別為(51.2±2.93)%、(98.10±1.76)%和(66.26±2.12)%，正常對照組(100%)與右美托咪定組相比細胞存活率無統計學意義(P>0.05)；多塞平組與正常對照組相比細胞存活率明顯降低(P<0.01)。而多塞平+右美托咪定組與正常對照組相比細胞存活率也明顯降低(P<0.01)，但卻明顯高于多塞平組(P<0.01)。

2.2 倒置顯微鏡下觀察PC12細胞形態 與正常對照組相比，右美托咪定組細胞形態無明顯變化。多塞平組PC12細胞貼壁能力減弱，體積變小變圓，突起變短變小。多塞平加右美托咪定組細胞較多塞平組貼壁能力增強，體積增大，突起部分恢復，見圖1。

圖1 PC12細胞經多塞平或(和)右美托咪定培養24 h后倒置光學顯微鏡下形態(×200)

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 與正常對照組〔(3.76±0.8)%〕比較，右美托咪定組細胞凋亡率〔(4.65±0.33)%〕無明顯增高(P>0.05)；多塞平組細胞凋亡率〔(49.5±1.24)%〕顯著增高(P<0.001)，多塞平右美托咪定組細胞凋亡率〔(30.34±1.05)%〕雖明顯高于正常對照組(P<0.01)，但明顯低于多塞平加組(P<0.01)。

3 討 論

多塞平作為三環類抗抑郁藥的主要代表藥物，具有與傳統的局部麻醉藥物類似的Na+離子通道阻斷作用，局部應用時可產生較強的脊髓神經麻醉、外周神經阻滯，并且在治療神經病理性疼痛中發揮重要作用〔1～3〕。但在前期研究中發現，多塞平在一定濃度范圍內有依賴性的神經細胞毒性；使用120 μmol/L多塞平處理PC12細胞時，會導致細胞存活率降低約50%〔6〕，同時顯微鏡下可觀察到PC12細胞貼壁能力減弱，細胞體積變小變圓，突起變短變小，因此在本研究中選用此濃度。

細胞凋亡是異于細胞壞死的另一種死亡形式，以細胞特征性的形態變化及細胞DNA片段化為重要特征。其主動性死亡程序是由多種信號通路參與完成的，Caspase介導途徑與凋亡征象密切相關，在細胞凋亡過程中起至關重要的作用。本課題組前期研究結果表明，120 μmol/L多塞平孵育PC12細胞后，倒置顯微鏡下可見明顯的細胞損傷性改變，存活率降低，凋亡率升高；給予Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK孵育后，PC12細胞形態學改變減輕，存活率升高，凋亡率降低，提示Caspase-3可能介導了多塞平誘發的神經細胞凋亡〔6〕。亦有其他研究表明，細胞凋亡是脊髓神經細胞損傷作用機制之一，除此之外還包括細胞炎癥反應、能量代謝障礙、鈣離子超載和活性氧的大量產生等〔10,11〕。

右美托咪定是一種具有鎮靜、鎮痛、抗焦慮、抑制交感神經興奮性及減少應激反應作用的高選擇性的α2腎上腺素受體激動藥。右美托咪定可以抑制Caspase活性，增加抗細胞凋亡蛋白生成且減少了促細胞凋亡蛋白生成，最終能夠降低神經細胞的凋亡率，從而增強神經細胞的生存能力〔12〕。Schoeler等〔13〕研究顯示，不同劑量的右美托咪定可保護外傷性腦損傷體外海馬細胞模型，在1 μmol/L時產生最大作用。因此，筆者假設能否應用右美托咪定替代Caspase-3抑制劑減少多塞平誘導的PC12細胞凋亡。

本實驗結果說明右美托咪定能保護多塞平導致的神經細胞毒性改變，從另一個角度進一步證實了多塞平神經毒性可以用右美托咪定來改善。